當(dāng)引物二聚體形成時，如果使用與 DNA 雙鏈結(jié)合的染料，在 NTC 反應(yīng)中也可觀察到熒光信號。無論是基于探針還是雙鏈 DNA 結(jié)合染料的反應(yīng)，在存在污染物的情況下，也可看到晚期擴增。A是擴增曲線B是溶解曲線。如果在每一個 NTC 反應(yīng)里都出現(xiàn)擴增，很可能是其中一種或兩種試劑被污染了。可采用以下步驟防止或去除污染。

1、使用干凈的工作臺，用帶核酸降解試劑的的溶液擦抹工作臺面。

2、用帶 dUTP 和 UDG 的反應(yīng)預(yù)混液降解來自前序 PCR反應(yīng)的產(chǎn)物，防止前序 PCR 反應(yīng)的污染。

3、 用新的反應(yīng)管通過置換不同來源的試劑，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)問題的試劑。

4、 在條件允許的情況下，在不同的實驗地點建立反應(yīng)，尤其是當(dāng)應(yīng)用質(zhì)粒作為對照時 (質(zhì)?？梢员缓苋菀讛U散并且難以去掉)。

  優(yōu)化實時熒光定量 PCR 反應(yīng)過程需要花費一定的時間，但是所花的時間是值得的。這樣得出的分析結(jié)果不僅具有最高的靈敏度和最大的動態(tài)范圍，而且效率高，重復(fù)性好。這些因素使數(shù)據(jù)具有可靠性，并最終為研究界所接受。

  在過去的數(shù)年中，實時熒光定量PCR 已成為DNA 或RNA檢測和定量的主要工具，所以，了解并解決實時熒光定量PCR實驗中的常見問題能使我們的結(jié)果更可靠。