聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）操作步驟

時間：2024/8/5閱讀：809

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，為常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一。操作步驟：
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer 5 μl
dNTP mix （2mM） 4 μl
　引物1（10pM） 2 μl
　引物2（10pM） 2 μl
Taq酶（2U/μl） 1 μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　 1 μl
加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，最后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μl氯仿進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

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