聚合酶鏈反應(PCR)技術是在體外進行的由引物介導的酶促DNA擴增反應。PCR的原理是在模板DNA、PCR引物、四種脫氧核糖核苷酸(dNTP)及適當濃度的Mg2+存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的體外酶促合成反應。兩個引物分別位于靶序列兩端，同兩條模板的3’端互補，由此限定擴增片段。PCR反應由一系列的變性→退火→延伸反復循環(huán)構成，即在高溫下模板雙鏈DNA變性解鏈，然后在較低溫度下同過量引物退火，再在適中溫度下由DNA聚合酶催化進行延伸。理論上，經過N次循環(huán)可使特定片段擴增到2n-1，考慮到擴增效率達不到100%，所以通常經25到30次循環(huán)可擴增到106倍，足夠后續(xù)實驗展開。

1.預變性

模板DNA全變性與PCR酶的全激活對PCR能否成功至關重要，建議加熱時間參考試劑說明書，一般未修飾的Taq酶激活時間為兩分鐘。

2.變性步驟

循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列全變性，可能的情況下可縮短該步驟時間。變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹di，易造成擴增失敗。

3.引物退火

退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴增的長度適當下調作為退火溫度。然后在此次實驗基礎上做出預估。退火溫度對PCR的特異性有較大影響。

4.引物延伸

引物延伸一般在72℃進行（Taq酶最適溫度）。但在擴增長度較短且退火溫度較高時，本步驟可省略延伸時間隨擴增片段長短而定，一般推薦在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設定為1min/kbp。

5.循環(huán)數(shù)

大多數(shù)PCR含25-35循環(huán)，過多易產生非特異擴增。

6.最后延伸

在最后一個循環(huán)后，反應在72℃維持10-30分鐘．使引物延伸全，并使單鏈產物退火成雙鏈。