PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)剖析:

1.預(yù)變性

模板DNAwan全變性與PCR酶的wan全激活對(duì)PCR能否成功至關(guān)重要，建議加熱時(shí)間參考試劑說(shuō)明書，一般未修飾的Taq酶激活時(shí)間為兩分鐘。

2.變性步驟

循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列wan全變性，可能的情況下可縮短該步驟時(shí)間。變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)損害酶活性，過(guò)短靶序列變性不徹di，易造成擴(kuò)增失敗。

3.引物退火

退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴(kuò)增的長(zhǎng)度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估。退火溫度對(duì)PCR的特異性有較大影響。

4.引物延伸

引物延伸一般在72℃進(jìn)行（Taq酶最適溫度）。但在擴(kuò)增長(zhǎng)度較短且退火溫度較高時(shí)，本步驟可省略延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長(zhǎng)短而定，一般推薦在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1min/kbp。

5.循環(huán)數(shù)

大多數(shù)PCR含25-35循環(huán)，過(guò)多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。

6.最后延伸

在最后一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)在72℃維持10-30分鐘．使引物延伸wan全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。