ELISA試劑盒HRP的制備方法

1).水提?。悍Q取5kg用水沖刷干凈的鮮辣根(辣根皮中亦含有豐富的HRP)，用菜刀切成小碎塊，在絞肉機(jī)中絞碎1～2次。碎渣漿用1倍體積的水低溫下攪拌提取過(guò)一夜(亦可采用高速抽提法)。次日用甩干機(jī)(或離心機(jī))甩干，收集濾液，碎渣再用1/4倍體積水浸泡提取1次，合并2次濾液，測(cè)得總體積。

2).硫酸銨分級(jí)分離：在不斷攪拌下，每1000mL濾液中慢慢加入226g硫酸銨粉末(相當(dāng)于0.40飽和度，0℃)，大約在1~2h內(nèi)加完，置冷室中放置過(guò)一夜。次日將上清液小心地用虹吸管移出，下面混濁液以3 000r/min離心15min，棄沉淀，合并上清液。再按每1000mL上清液加258g硫酸銨粉末(0.8飽和度)隨加隨攪拌，當(dāng)硫酸銨全部溶解后，置冷室過(guò)一夜。次日，虹吸出上清液，沉淀部分在冰凍離心機(jī)中以13000r/min離心20min，棄去上清液，收集沉淀。將沉淀懸浮于100~150mL蒸餾水中(加水量要使沉淀全部溶解為止)，分裝于透析袋內(nèi)，放在流動(dòng)自來(lái)水中進(jìn)行透析1～2天，直到硫酸銨透析完畢為止(可用5%乙酸鋇溶液或奈氏試劑進(jìn)行檢查)。然后改換成用蒸餾水透析，中間更換2~3次，用0.1mol/L硝酸銀溶液檢查透析外液無(wú)氯離子為止。將透析液合并，在冰凍離心機(jī)中以4 000r/min離心15min，棄去沉淀，量上清液的體積。