正常肺細(xì)胞培養(yǎng)操作方法

取出小鼠細(xì)胞系正常肺組織, 在預(yù)冷的PBS液中盡量除去氣管、支氣管、血管組織, 將小鼠肺組織上面的血污用PBS清洗后, 剪成1 mm3 小塊, 用0.25%的胰酶溶液清洗一次, 繼續(xù)用 0.25%的胰酶在37 °C下攪動(dòng)消化10~20 min。之后加入等量的含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化, 200 目篩網(wǎng)過(guò)濾后, 1 500 r/min低溫離心5 min, 去上清, 再將沉淀加入0.1% I型膠原酶在37 °C下消化10~20 min,加入含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化, 1 000 r/min離心5 min。將細(xì)胞系懸液接種于培養(yǎng)瓶中, 置37 °C、5% CO2的培養(yǎng)箱中培育40 min, 此時(shí)貼壁的為成纖維細(xì)胞, 懸浮的多數(shù)為肺泡II型上皮細(xì)胞和其他雜細(xì)胞。

將培養(yǎng)液吸出置于另一瓶中, 繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培育 40 min, 反復(fù)2~3次, Z后吸出培養(yǎng)液, 800 r/min離心 5 min, 去上清, 用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸沉淀細(xì)胞。接種于培養(yǎng)瓶置37 °C、5% CO2的培養(yǎng)箱中培育, 留少量細(xì)胞做免疫化學(xué)實(shí)驗(yàn), 用鼠抗SP-C 為一抗, Alexa Fluor 594標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗, 確認(rèn)為肺泡II型上皮細(xì)胞系后備用。