小鼠垂體瘤細(xì)胞具體步驟

1. 水：

細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水.

2. PBS (也可用于其它BSS，如：Hanks，D-hanks液的配制)：

主要用于免疫組化染色時(shí)組織或細(xì)胞的漂洗

溶解定容：將藥品(NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4•H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g )倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動(dòng)，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準(zhǔn)確定容至1000ml，搖勻即成新配制的PBS溶液。用HCl或NaOH調(diào)PH到7.4。

移入溶液瓶?jī)?nèi)待消毒：將PBS倒入溶液瓶(大的吊針瓶)內(nèi)，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi)8磅消毒20分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水份。

3. *溶液：

*的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對(duì)*的作用反應(yīng)不一樣。*分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時(shí)間有關(guān)，在pH為8.0、溫度為37℃時(shí)，*溶液的作用能力zui強(qiáng)。使用*時(shí)，應(yīng)把握好濃度、溫度和時(shí)間，以免消化過(guò)度造成細(xì)胞損傷。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白質(zhì)克降低*的活性，所以配制*溶液時(shí)應(yīng)選用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。終止消化時(shí)，可用含有血清培養(yǎng)液或者*抑制劑終止*對(duì)細(xì)胞的作用。

稱取*：按*液濃度為0.25%，用電子天平準(zhǔn)確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水(若用雙蒸水需要調(diào)PH到7.2左右)或PBS(D-hanks)液中。攪拌混勻，置于4℃內(nèi)過(guò)夜。

用注射濾器抽濾消毒：配好的*溶液要在超凈臺(tái)內(nèi)用注射濾器(0.22微米微孔濾膜)抽濾除菌。然后分裝成小瓶于-20℃保存以備使用。

4. 0.05%*-0.02%EDTA溶液

稱取*粉末(1：250) 0.05g，EDTA 0.02g，加入PBSA 100ml，0.22um微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝，于-20℃保存。

5. 青、*溶液：

所用純凈水(雙蒸水)需要15磅高壓20分鐘滅菌。 具體操作均在超凈臺(tái)內(nèi)完成。*是80萬(wàn)單位/瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。*是100萬(wàn)單位/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬(wàn)單位。 分裝于-20℃保存。使用時(shí)溶入培養(yǎng)液中，使青*的濃度zui終為100單位/ml。

6. RPMI1640：

溶解、調(diào)PH值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積2/3的雙蒸水中,并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3次(沖洗液一并加入培養(yǎng)基中),充分?jǐn)嚢柚练蹌┤咳芙?并按照包裝說(shuō)明添加一定的藥品.然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青*液各0.5ml, 使青*的濃度zui終各為100單位/ml。然后用二氧化碳或*調(diào)PH到7.2左右。zui后定容至1000ml，搖勻。

安裝蔡式濾器：安裝時(shí)先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。

抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過(guò)濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺(tái)內(nèi)過(guò)濾。

分裝：將過(guò)濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶?jī)?nèi)置于4℃冰箱內(nèi)待用。

使用前要向100ml培養(yǎng)液中加入1ml*溶液(4℃時(shí)兩周有效)。

7. 血清的滅活：

細(xì)胞培養(yǎng)常用的是小牛血清，新買(mǎi)來(lái)的血清要在56℃水浴中滅活30分鐘后，再經(jīng)過(guò)抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。

8. HEPES溶液：

HEPES的化學(xué)全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸(N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid )。對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長(zhǎng)時(shí)間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為10-50mmol/L，一般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmol/LHEPES即可達(dá)到緩沖能力。