細胞凋亡檢測的早期形態(tài)學改變是核染色質(zhì)濃聚、固縮,聚集在核膜周邊,然后是胞漿濃縮、胞膜起泡,繼而細胞核裂解成若干碎片,細胞膜將胞質(zhì)和染色質(zhì)斷片包裹,胞漿內(nèi)形成多個膜結(jié)構(gòu)尚完整的“小泡”及 “凋亡小體” (apoptoticbody)。這不同于細胞壞死的細胞腫脹、胞膜破裂、細胞崩解。
根據(jù)凋亡細胞固有的形態(tài)特征，至今為止，人們已經(jīng)設(shè)計了許多不同的細胞凋亡形態(tài)學檢測方法。
一、光學顯微鏡觀察
凋亡細胞的主要特征為核染色質(zhì)致密深染，形成致密質(zhì)塊，有時可碎裂。在HE染色的組織切片中細胞體積縮小，胞質(zhì)致密、嗜酸性染色增強，并可形成凋亡小體。在組織中凋亡細胞常以分散單個形式存在，凋亡細胞與周圍細胞分離，不引起炎癥反應(yīng)。

本方法簡便易行，但在細胞密集的組織中對于改變不典型的細胞判斷較困難，常缺乏較為特征的指標，具有較強的主觀性，重復(fù)性差。本方法可用于調(diào)亡現(xiàn)象的初步觀察，作為分析指標之一。

檢測方法：細胞涂片或組織石蠟切片作HE染色或Giemsa染色，在高倍物鏡下觀察凋亡細胞的形態(tài)改變，結(jié)合顯微測量工具可作凋亡細胞計數(shù)。

二、視頻時差顯微技術(shù)
本方法用于細胞培養(yǎng)，通過相差顯微鏡可動態(tài)觀察細胞凋亡的變化過程，尤其是觀察細胞表和外形的變化。凋胞與基質(zhì)分離，胞體變圓、收縮、出泡，有的細胞拉長，出現(xiàn)釘狀突起，特續(xù)數(shù)小時后細胞膜破裂，細胞溶解，通過連續(xù)觀察，本方法可養(yǎng)壑培養(yǎng)中的凋亡細胞，但不能用于病理組織。

檢測方法：收集2×105細胞/ml培胞，置于多孔培養(yǎng)板，加入凋亡誘導劑，在帶有自動攝像裝置的相差顯微鏡下觀察凋亡細胞的動態(tài)改變，每隔分鐘30秒作序列攝影，連續(xù)24小時。如同進進行熒光染色，可參熒光晃微鏡下觀察和攝影。
三、電子顯微鏡觀察
雖然光學顯微鏡下可以看見胞膜起泡現(xiàn)象和凋亡小體,但凋亡細胞的形態(tài)學變化大多發(fā)生在超微結(jié)構(gòu),因此用光鏡觀察難以令人滿意,而透射電鏡可清楚地觀察到細胞結(jié)構(gòu)在凋亡不同時期的變化。電鏡形態(tài)學觀察是迄今為止判斷凋亡經(jīng)典、可靠的方法,被認為是確定細胞凋亡的金標準。

缺點：
(1)只能定性,不能定量;
(2)標本處理過程復(fù)雜,設(shè)備相對昂貴,對檢查者的技術(shù)水平要求較高,不適于大批標本檢測;
(3)在組織切片上進行電鏡觀察時,有時凋亡很難與正常細胞有絲分裂相鑒別,因為兩種情況下都可出現(xiàn)染色質(zhì)濃聚。如同時進行熒光染色,可彌補電鏡檢查的不足。

檢測方法：透射電鏡標本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定，丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸電子又重染色，透射電鏡觀察。掃描電鏡標本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定，乙醇逐級脫水，CO2臨界點干燥，真空噴金，掃描電鏡觀察。

四、流式細胞技術(shù)
流式細胞儀檢測凋亡細胞是通過檢查其光射特征及熒光參數(shù)時行的。細胞穿過流式細胞儀的激光束集點時使激光發(fā)生散射，分析散射光可以提供細胞大小及結(jié)構(gòu)的信息。散射光包括前向散射光和左向角散射光兩種，前向散射光的強度與細胞大小、體積相產(chǎn)，右向角射光的強度與細胞結(jié)構(gòu)的析射性、顆粒性（granu-larity）有關(guān)。

細胞凋亡過程中出現(xiàn)的形態(tài)改變?nèi)缂毎櫩s、胞膜起泡、核濃縮和碎裂等可以使光散射特性發(fā)生改變。早期凋亡細胞主要表現(xiàn)為前向散射光減弱而右向角散射光增強或不變，前者反映了細胞的皺縮，后者反映了細胞的核逐縮及碎裂。晚期凋亡細胞的前向散射光和右向角散射光均減弱。

由于光散射牧場生并非凋亡細胞的特異性指標，細胞的機械性損傷和細胞壞死也可以使前向散射光減弱。因此，只有將光散射特性的檢測與熒光參數(shù)的檢測結(jié)合起來才能準確地辨認凋亡細胞。

細胞凋亡過程中核酸內(nèi)切酶在DNA分子核小體間的降解，導致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，細胞熒光染色后作流式細胞儀分析，可以發(fā)現(xiàn)在DNA直方圖上正常二倍體細胞的Go/G1峰前出現(xiàn)一個亞二倍體峰（xub-G1峰，即AP峰--apoptotic peak）,代表凋亡細胞。

細胞凋亡檢測根據(jù)此亞二倍體峰可以計算凋亡細胞的百分率。此外，流式細胞術(shù)還可以通過測定線粒體膜的電位、溶酶體質(zhì)子泵的活性及細胞DNA/總蛋白質(zhì)比例等方法辨認凋亡細胞。

檢測方法：獲取密度1×106細胞/ml左右的細胞懸液，精洗，固定，熒光染料染色，上流式細胞儀分析。
250    TAT Broth    用于化妝品和微生物檢測(Acumedia方法)    TAT肉湯
250    Fungi Medium    用于生物制品霉菌無菌試驗（GB標準）    真菌培養(yǎng)基 
250    Yeast Peptone Dextrose Agar    用于測定酵母菌總數(shù)（GB標準）    YPD瓊脂  
250    Antibiotic Agar     用于*，*，*，*等效價測定    抗生素檢定培養(yǎng)基1號（高PH）  
250    Antibiotic Agar     用于磺芐*效價測定    抗生素檢定培養(yǎng)基1號（低PH）  
250    Antibiotic Agar No.2    用于*，*等效價測定    抗生素檢定培養(yǎng)基2號（高PH）  
250    Rose Bengal Medium    用于霉菌、酵母菌計數(shù)    玫瑰紅鈉瓊脂   
250    Broth Medium    細菌培養(yǎng)，滴眼劑*培養(yǎng)等    5%*   
細胞凋亡檢測