磺胺類藥物通常被稱為“磺胺類藥物"——磺胺類的衍生物（對氨基苯磺胺）。由于其抗菌性強、成本低、毒性低，常被用作獸醫(yī)治療常見細菌性疾病的抗菌藥物。獸藥的無節(jié)制使用和不遵守停藥期可能導(dǎo)致治療后藥物殘留在動物組織中。這些殘留物可以通過動物的乳汁傳染給人類。通常的做法是對奶牛使用各種抗生素進行不同的治療，但這最終會導(dǎo)致抗生素殘留物在牛奶中積累，當人類食用時會引起過敏反應(yīng)和毒性作用。
歐盟監(jiān)管機構(gòu)發(fā)布了一系列文件，旨在更好地規(guī)范獸藥的控制以保護消費者。理事會指令96/23/EC7概述了對食用動物中獸藥殘留的控制。
在印度，F(xiàn)SSAI（2018年7月20日公報）和EIC（用于水產(chǎn)養(yǎng)殖、雞蛋、蜂蜜、奶牛等的RMP）要求對抗生素進行早期和頻繁的分析。EIC和FSSAI已經(jīng)為動物食品基質(zhì)中常見的一系列特定抗生素殘留建立了殘留(MRL)。檢測牛奶中的磺胺類藥物殘留對于維護消費者安全和防止他們接觸獸藥至關(guān)重要。本文概述了一種快速靈敏的LC-MS/MS方法，用于定量分析牛奶中的磺胺類抗生素。
實驗性的硬件和軟件
PerkinElmer LX-50 UHPLC 系統(tǒng)用于色譜分離，同時通過配備 ESI 和 APCI 電離源的 PerkinElmer QSight™ 220 三重四極桿質(zhì)譜儀進行檢測。
儀器控制、數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)處理均使用 Simplicity 3Q™ 軟件在一個窗口中進行。表 1 提供了 LC 參數(shù)，包括色譜柱和流動相梯度程序。
表 1. UHPLC 參數(shù)。資料來源：珀金埃爾默食品安全和質(zhì)量
| 液相色譜柱 | Univ C18AQ 100 mm X 3 mm X
2.1μm (P/N N9304784) |
|---|
| 流動相 A | 0.1% 甲酸水溶液 |
| 流動相 B | 0.1% 甲酸的乙腈溶液 |
| 流動相梯度 | | 先生號 | 時間 | ％一種 | %B |
|---|
| 1 | 0.00 | 98 | 2 | | 2 | 1.50 | 98 | 2 | | 3 | 6.00 | 4 | 96 | | 4 | 6.50 | 4 | 96 | | 5 | 7.00 | 98 | 2 | | 6 | 7.50 | 98 | 2 |
|
| 柱溫箱溫度 | 40oC |
| 自動進樣器溫度 | 15℃ |
| 注射量 | 10 微升 |
| 流動 | 0.5 毫升/分鐘 |
| 運行 | 7.5 分鐘 |
| ESI 電壓 (+Ve) | 5300 |
| 干燥氣體 | 110 |
| 霧化器氣體 | 300 |
| 源溫度 | 300 |
| HSID 溫度 | 220 |
材料:試劑和化學(xué)品
所有 CRM、試劑和化學(xué)品均為 NIST 可溯源和 LC-MS/MS 級。該研究還使用了 1 型水。
方法儲備溶液和校準標準品的制備
用 10 mg/L 所有分析物的 10 mL 標準混合物制備儲備溶液。這是通過從母液到 10 mL 容量瓶的適當體積來實現(xiàn)的，然后為每種抗生素分析物使用適當?shù)娜軇?br>
標準溶液均保存在 -20 oC。通過用水:乙腈 (80:20, v/v) 連續(xù)稀釋儲備溶液的工作溶液 (5, 10, 25, 50, 100 和 200 ng/ml) 制備校準標準品。
樣品提取程序將總共?? 2 g ± 0.1 g 的樣品稱重到 50 mL PTFE 離心管中。
在將其在渦流中搖動30秒并放置30分鐘之前，添加總共4mL的水。
總共加入 10 mL 乙酸乙酯，然后將其在渦旋中搖動 2-3 分鐘，以確保溶劑和分析物的適當相互作用。
將樣品以 10000 rpm 離心 10 分鐘。
將總共?? 5 mL 上清液加入到蒸發(fā)管中，并在 40 oC 的氮氣蒸發(fā)器下蒸發(fā)至干。
樣品用 1 mL 乙腈:水 (80:20, v/v) 復(fù)溶并渦旋。
然后通過 0.2 µm 濾紙過濾樣品。
結(jié)果與討論
線性研究通過六個校準點涵蓋 5 µg/L 至 200 µg/L 的濃度水平。該方法對牛奶基質(zhì)中研究的所有抗生素均表現(xiàn)出出色的線性，R 2 >0.99。所有抗生素的定量限 (LOQ) 均達到 10 µg/L。
表 2.基質(zhì)效應(yīng)。資料來源：珀金埃爾默食品安全和質(zhì)量
| 分析物 | 溶劑標準區(qū)。 | 矩陣匹配區(qū)域。 | ％ 我 |
|---|
| 磺胺甲氧基吡啶 | 50655 | 80960 | 60 |
| 38731.8 | 43709 | 13 |
| 10873.6 | 43955.7 | 304 |
| 18719.4 | 56815 | 204 |
| 76718.8 | 122715 | 60 |
| 72406.6 | 111414.3 | 54 |
| 磺胺異惡唑 | 94119.2 | 154994.2 | 65 |
| 磺胺喹惡唑 | 30548.2 | 37611.5 | 23 |
| 磺胺喹喔啉 | 29353 | 37376 | 27 |
表 3.分析物的 MRM 離子對和保留時間。資料來源：珀金埃爾默食品安全和質(zhì)量| 分析物 | 前體 | 產(chǎn)品一 | 行政長官 1 | 產(chǎn)品 2 | 行政長官 2 | 逆轉(zhuǎn)錄 |
|---|
| 磺胺甲氧基吡啶 | 281 | 156 | -23 | 65 | -78 | 3.68 |
| 256 | 156 | -20 | 65 | -73 | 6.07 |
| 251 | 156 | -22 | 108 | -34 | 3.08 |
| 250 | 156 | -22 | 184 | -23 | 3.24 |
| 271 | 156 | -19 | 92 | -41 | 3.50 |
| 285 | 156 | -20 | 108 | -38 | 3.76 |
| 磺胺異惡唑 | 268 | 156 | -19 | 113 | -20 | 3.95 |
| 磺胺喹惡唑 | 301 | 156 | -23 | 92 | -48 | 4.15 |
| 磺胺喹喔啉 | 301 | 156 | -23 | 208 | -25 | 2.15 |
基質(zhì)效應(yīng)將基質(zhì)匹配標準品的響應(yīng)（萃取前加標的峰面積）與溶劑中標準品的相應(yīng)峰面積進行比較。這是在六次重復(fù)中完成的。該程序允許使用基質(zhì)標準的面積和溶劑標準的面積（表2）將基質(zhì)效應(yīng)（ME）量化為峰面積的平均抑制或增強百分比。負ME值表示矩陣誘導(dǎo)的信號抑制，而正值表示信號增強。恢復(fù)研究所有化合物的回收率通過在10、25和50µg/kg水平上加標6次重復(fù)的牛奶樣品來確定。發(fā)現(xiàn)所有分析物的回收率都在80%和120%之間，而所有化合物的RSD百分比均低于20%-符合法規(guī)要求的可接受值。表4、5和6代表三次回收率和回收率以及RSD。完成最終稀釋因子的計算后，重復(fù)分析六次數(shù)據(jù)。表 4. 10 μg/kg 加標時的回收率，實際加標時稀釋 5 倍。資料來源：珀金埃爾默食品安全和質(zhì)量
| 分析物 | 建議 1 | 建議 2 | 建議 3 | 建議 4 | 建議 5 | 建議 6 | 平均 | 標準差 | %RSD | ％ 恢復(fù) |
|---|
| 磺胺甲氧基吡啶 | 10.73 | 10.61 | 10.61 | 10.00 | 10.60 | 10.89 | 10.57 | 0.30 | 2.88 | 105.72 |
| 10.60 | 9.39 | 8.98 | 7.92 | 6.88 | 7.73 | 8.58 | 1.34 | 15.58 | 85.83 |
| 9.51 | 8.84 | 9.38 | 10.97 | 10.10 | 9.16 | 9.66 | 0.76 | 7.92 | 96.60 |
| 10.05 | 8.33 | 9.54 | 10.55 | 8.86 | 9.56 | 9.48 | 0.80 | 8.42 | 94.81 |
| 10.25 | 9.88 | 9.95 | 9.28 | 9.10 | 8.94 | 9.57 | 0.53 | 5.52 | 95.65 |
| 10.86 | 10.27 | 10.75 | 10.06 | 10.48 | 10.54 | 10.49 | 0.30 | 2.83 | 104.94 |
| 磺胺異惡唑 | 10.29 | 10.39 | 10.08 | 9.81 | 9.81 | 9.93 | 10.05 | 0.25 | 2.45 | 100.53 |
| 磺胺喹惡唑 | 10.42 | 10.31 | 10.39 | 9.27 | 9.19 | 9.92 | 9.92 | 0.56 | 5.64 | 99.16 |
| 磺胺喹喔啉 | 10.41 | 10.35 | 10.71 | 9.67 | 9.81 | 10.63 | 10.26 | 0.43 | 4.19 | 102.64 |
表 5. 25 μg/kg 加標時的回收率，實際加標時稀釋 5 倍。資料來源：珀金埃爾默食品安全和質(zhì)量
| | 分析物 | 建議 1 | 建議 2 | 建議 3 | 建議 4 | 建議 5 | 建議 6 | 平均 | 標準差 | %RSD | ％ 恢復(fù) |
|---|
| 磺胺甲氧基吡啶 | 26.00 | 26.84 | 26.07 | 19.43 | 18.88
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