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新一代二極管矩陣檢測(cè)器

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產(chǎn)品型號(hào)UV6000

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更新時(shí)間:2018-05-15 13:53:12瀏覽次數(shù):2565次

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用UV6000LP測(cè)定抗生素Cephalexin(*),其檢測(cè)極限降低了四倍,而在以往這只能依靠高靈敏度的可變波長(zhǎng)檢測(cè)器來(lái)實(shí)現(xiàn)。

  在過(guò)去的十年中,二極管矩陣檢測(cè)器(PDA)已成為HPLC系統(tǒng)中zui常用的UV/VIS檢測(cè)器之一。這種趨勢(shì)的主要原因在于,采用PDA進(jìn)行檢測(cè)在獲得定量數(shù)據(jù)的同時(shí),還可獲取定性數(shù)據(jù),如吸收光譜。對(duì)于特定分析,在確定*檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí),采集的光譜數(shù)據(jù)是非常有用處的。光譜也常用于化合物的鑒定。分析專(zhuān)家經(jīng)常使用光譜信息來(lái)確定是否存在由于被檢測(cè)物質(zhì)降解或轉(zhuǎn)化所生成的雜質(zhì)。因此,PDA在分析研究、方法開(kāi)發(fā)和藥物代謝實(shí)驗(yàn)中,得到了廣泛的發(fā)展。
  靈敏度對(duì)于任何檢測(cè)器而言,都是zui重要的指標(biāo)。過(guò)去的PDA,盡管可提供重要的定性信息,但其靈敏度要遜于目前的可變波長(zhǎng)紫外/可見(jiàn)檢測(cè)器。在1997年TSP公司開(kāi)發(fā)出新產(chǎn)品UV6000LP(PDA)之前的十年中,PDA在靈敏度提高方面進(jìn)展甚微。與目前的可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器相比,由于UV6000LP采用了全新的技術(shù)產(chǎn)品--50mm光導(dǎo)管流通池,從而*地提高了PDA的靈敏度。
  本文中,我們將舉例說(shuō)明,用UV6000LP測(cè)定抗生素Cephalexin(*),其檢測(cè)極限降低了四倍,而在以往這只能依靠高靈敏度的可變波長(zhǎng)檢測(cè)器來(lái)實(shí)現(xiàn)。

靈敏度對(duì)化合物鑒定的重要性:

  高靈敏度檢測(cè)器,可帶來(lái)諸多便利。首先檢測(cè)極限的降低,使分析人員可檢測(cè)含量更低的化合物。此外,在低檢出量時(shí),高靈敏度增加了數(shù)據(jù)的可信度,從而提高了定性分析的準(zhǔn)確性。對(duì)于PDA檢測(cè)器而言,的靈敏度有著更為重要的意義。由于PDA可提供光譜信息,因此由高靈敏度而產(chǎn)生的高質(zhì)量光譜圖,使得未知物鑒定更為容易。

降低基線噪音的挑戰(zhàn):

  描述一個(gè)給定檢測(cè)器相對(duì)靈敏度zui重要的指標(biāo)是它的信噪比。提高檢測(cè)器靈敏度有兩種可行的方法:增加所給出樣品的信號(hào),或降低短程基線噪音。

檢測(cè)器的基線噪音主要有四個(gè)影響因素:

1. 當(dāng)光強(qiáng)很大時(shí),可變波長(zhǎng)使用的硅 光電二極管和二極管矩陣檢測(cè)器性能*。當(dāng)光強(qiáng)減弱時(shí),短程噪音隨之增加。因此在設(shè)計(jì)檢測(cè)器時(shí),應(yīng)盡可能地增加光通過(guò)量。

2. 模擬電路和光電構(gòu)件均造成短程噪音,而且這些構(gòu)件都是定制的,因此在制作時(shí)要綜合考慮成本和性能兩個(gè)方面。

3. 檢測(cè)器靈敏的模擬電路,受微處理器,變壓器和電源的電磁干擾(EMI)。受檢測(cè)器體積的限定,很難將模擬電路與發(fā)射EMI的原件隔開(kāi)。

4. 在信號(hào)處理中,模擬和數(shù)字過(guò)濾也會(huì)影響基線噪音。有兩種常用的過(guò)濾器可用來(lái)降低檢測(cè)器的基線噪音。響應(yīng)時(shí)間過(guò)濾器用在時(shí)間軸線上,而頻帶寬度過(guò)濾器則用在波長(zhǎng)軸線上,但存在著二者相互關(guān)聯(lián)的綜合考慮問(wèn)題。盡管二者都能很好地工作,并且降低了基線的噪音,但一超過(guò)兩秒鐘,響應(yīng)時(shí)間過(guò)濾器就會(huì)引起頻帶擴(kuò)展,從而降低色譜的分辯率。在另一軸上,頻帶寬度過(guò)濾器在提高靈敏度的同時(shí)也降低了光譜分辯率。

  基于以上因素,近年來(lái),液相色譜檢測(cè)器制造商很少采用通過(guò)降低短程噪音的方法來(lái)增加檢測(cè)器的靈敏度。

圖1.

采用光導(dǎo)管流通池增加信號(hào):

  現(xiàn)在,我們討論一下影響靈敏度的另一個(gè)因素--信號(hào)。比爾朗伯定律表明了一種化合物的吸收值與其自身摩爾吸收率(S),流通池的長(zhǎng)度(b)及樣品的濃度(c)之間的關(guān)系。*(S)和第三(c)因素,均無(wú)法提供改進(jìn)檢測(cè)器靈敏度的途徑。然而,增加檢測(cè)器流通池的長(zhǎng)度,則可成倍增加檢測(cè)器的信號(hào)。



圖 1
  的光導(dǎo)管流通池內(nèi)壁由一種特殊材料制成,可將光信號(hào)全部反射回流通池中部,而管壁不吸收任何光信號(hào),因而易于降低短程基線噪音。根據(jù)內(nèi)部折射加和的光纖通信基礎(chǔ)技術(shù)原理,的光導(dǎo)管流通池將其光程增至為50mm。而體積同為10ml的一般檢測(cè)器,其流通池光程僅為10mm。所以,根據(jù)比爾定律,增加光程因子5倍可引起信號(hào)因子增加5倍。

降低Cephalexin的檢測(cè)極限:

  根據(jù)制藥管理規(guī)定,成品藥中的降解雜質(zhì)含量不得超過(guò)0.1%。Cephalexin是一種不穩(wěn)定的抗生素,因此制藥廠必須做降解產(chǎn)物的常規(guī)分析。 圖1所示:分析一個(gè)10ng Cephalexin試樣,將其注入一個(gè)Hypersil?C8(10cm, 5mm)色譜柱。HPLC系統(tǒng)由TSP的 SpectraSystem體系構(gòu)成,包括一個(gè)P4000梯度泵、AS3000自動(dòng)進(jìn)樣器和一個(gè)可變波長(zhǎng)檢測(cè)器(帶常規(guī)10mm流通池)。同時(shí),此系統(tǒng)與UV6000LP二極管矩陣檢測(cè)器(帶50mm流通池)聯(lián)接。兩個(gè)檢測(cè)器測(cè)定波長(zhǎng)均為260mm,即在Cephalexinzui大吸收波長(zhǎng)處。使用新的ChromQuest?軟件控制HPLC系統(tǒng),并提供光譜分析和譜庫(kù)對(duì)比功能。

  在可變波長(zhǎng)檢測(cè)器上得到的峰高為1.18mAU,而在UV6000LP給出的響應(yīng)值為6.24mAU。這恰好驗(yàn)證了比爾定律,UV6000LP的吸收比可變波長(zhǎng)檢測(cè)器高出了5倍。短程基線噪音由于光的高通量而減至zui少,這是由于采用內(nèi)部折射加和技術(shù)的直接結(jié)果。為了簡(jiǎn)化兩個(gè)檢測(cè)器的比較,我們計(jì)算出Cephalexin的檢出極限(LOD),將它作為化合物檢測(cè)的zui小量,化合物所產(chǎn)生的信號(hào)相當(dāng)于短程噪音的兩倍。計(jì)算出的定量極限(LOQ)為短期噪音的10倍。這些結(jié)果均列于表1中。
 
 可變波長(zhǎng)檢測(cè)器UV6000LP
2倍短程噪音340pg 60mAU
校正響應(yīng)值 8.5pg/mAU 1.6pg/mAU
檢出極限(LOD)40mAU 96pg
定量極限(LOQ) 1700pg480pg

表1. 檢測(cè)結(jié)果比較

  以上結(jié)果顯示出,UV6000LP是如何通過(guò)增加靈敏度而降低Cephalexin的 LOD和LOQ值的。UV6000LP與可變波長(zhǎng)檢測(cè)器相比,由于性能的改進(jìn),使得其LOD值比原來(lái)降低了大約70%。此例也表明,檢測(cè)和定量分析比以前含量更低的化合物已成為可能 。

更好的定量精度:

  增加靈敏度的另一好處,便是改善了低含量樣品數(shù)據(jù)的精度。為了說(shuō)明該效應(yīng),我 們配制樣品濃度為100pg-500pg,在此濃度范圍內(nèi)反復(fù)進(jìn)樣。在每一濃度下,將所得到的檢測(cè)器響應(yīng)值進(jìn)行平均,并計(jì)算出其%RSD。

表2. 低樣品含量的峰高精度

樣品含量可變波長(zhǎng)檢測(cè)器UV6000LP
500pg5.11.4
400 pg6.22.0
300 pg8.91.1
200 pg13.12.4
150 pg86.73.0
100 pgNA7.4

  圖2所示為試樣從150pg到250pg范圍內(nèi)可變波長(zhǎng)檢測(cè)器的較正曲線。在試樣濃度100pg時(shí),其響應(yīng)值是測(cè)不到的。較正曲線相關(guān)較正系數(shù)為0.9965。圖3所示為同樣樣品濃度范圍內(nèi)UV6000LP的校正曲線。因?yàn)閁V6000LP有較高的靈敏度,所以在樣品濃度為100pg時(shí)有響應(yīng)值。曲線在此點(diǎn)有響應(yīng)值,并不影響相關(guān)系數(shù),相關(guān)因子仍增到0.9992--這說(shuō)明UV6000LP在低含量的精度有顯著的改進(jìn)。圖4從另一角度來(lái)說(shuō)明UV6000LP的特性。將兩種檢測(cè)器在不同濃度下的RSD值作圖??勺儾ㄩL(zhǎng)檢測(cè)器在150pg濃度時(shí),RSD約為85%左右,這對(duì)檢測(cè)工作無(wú)太大的意義。只有濃度提高到250pg,檢測(cè)器的值才呈現(xiàn)出常數(shù)。然而,對(duì)于UV6000LP,在150pg即有響應(yīng)值了。
  此例說(shuō)明了由于UV6000LP采用"光導(dǎo)管"技術(shù),從而在低樣品含量檢測(cè)時(shí),大大改進(jìn)其數(shù)據(jù)的定量精度。表2總結(jié)了在不同水平的%RSD數(shù)據(jù)。

圖 3







圖4

更高質(zhì)量的光譜:

  以上示例說(shuō)明增加靈敏度可以改善定量數(shù)據(jù),即使得低含量化合物的精確測(cè)量和定量成為可能。由PDA產(chǎn)生的吸收光譜,常用于不純物質(zhì)的定性鑒別。例如,吸收光譜可用于鑒定雜質(zhì)是否來(lái)自于主要成份的降解產(chǎn)物,或者產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程是否發(fā)生變化。
  該實(shí)驗(yàn)同樣表明,對(duì)于低含量樣品,較高的靈敏度可產(chǎn)生較強(qiáng)的信號(hào),從而光譜數(shù)據(jù)得以改進(jìn)。對(duì)一個(gè)480pg的Cephalexin樣品(zui低檢出限)進(jìn)行檢驗(yàn)。ChromQuest™軟件將它的吸收光譜與參考譜庫(kù)進(jìn)行比較。該試樣與以往用一個(gè)大劑量樣品所做的譜圖相匹配,其譜庫(kù)匹配系數(shù)為992。當(dāng)匹配系數(shù)大于990,則意味著互相關(guān)聯(lián)程度較大。
  此例說(shuō)明,SpectraSYSTEMUV6000LP并不像以往的PDA那樣,在提高光譜靈敏度的同時(shí),降低分辯率。

結(jié)論:

  本文討論了檢測(cè)器靈敏度對(duì)色譜儀的重要性。盡管一些因素制約了檢測(cè)器靈敏度的提高,但TSP仍成功地將內(nèi)折射加和原理和比爾朗伯定律運(yùn)用在HPLC流通池的開(kāi)發(fā)中,其光導(dǎo)管流通池的靈敏度提高了五倍。靈敏度(信噪比)的顯著提高反過(guò)來(lái)使LOD和LOQ值降低了五倍。以上數(shù)據(jù)清晰地表明,改善了靈敏度的UV6000LP,為分析人員定量和定性分析提供了更加可靠的信息。

UV6000LP 光電二極管陣列檢測(cè)器規(guī)格指標(biāo)
Wavelength Range
190 - 800nm
Rise time Filter
Bessel 0.1 to 10 sec
Wavelength Accuracy
± 1nm @ 254nm
Bandwidth Filter
Savitsky-Golay, 1 nm - 59 nm
Array
512 pixels
Analog Outputs
2 unattenuated 20-bit at 10 mV, 100mV or 1V per AU
Spectral Resolution
1.2 nm, digital
Data Rate
0.5 - 20 Hz
Absorbance Linearity
*2.0 AU @ 254nm
Digital Inputs
Run and zero
Cell Pathlength
50 nm
Digital Outputs
Run, ready and event
Drift*
1 ′10-3 AU/hr @ 254 nm
Dimensions
18 cm ′ 34 cm ′ 43 cm (H′W′D)
*ASTM E1657-94, per 10 mm pathlength, 4 mm bandwidth, 2 sec rise, MeOH 1mL/min

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