線粒體功能異常與代謝重編程是神經(jīng)退行性疾病、腦衰老等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的核心機(jī)制。常規(guī)細(xì)胞樣本、離體線粒體檢測(cè)模式，無(wú)法復(fù)刻腦組織復(fù)雜的細(xì)胞互作與組織微環(huán)境，數(shù)據(jù)與在體真實(shí)代謝狀態(tài)偏差較大。而急性腦片穿孔結(jié)合Seahorse能量代謝檢測(cè)，突破傳統(tǒng)僅適用于細(xì)胞樣本的局限，實(shí)現(xiàn)**完整組織層面**的離體腦代謝精準(zhǔn)表征，是目前更貼近生理真實(shí)狀態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)化研究方案。

一、技術(shù)優(yōu)勢(shì)：為什么選急性腦片+Seahorse？

• 保留神經(jīng)元?膠質(zhì)細(xì)胞天然代謝偶聯(lián)，更接近在體代謝狀態(tài)

• 組織級(jí)實(shí)時(shí)檢測(cè)，同步讀取 OCR（線粒體呼吸） + ECAR（有氧糖酵解），打破傳統(tǒng)細(xì)胞檢測(cè)的局限性

• 雙條件對(duì)照：有糖（葡萄糖）/無(wú)糖（蔗糖），精準(zhǔn)區(qū)分底物依賴

• 一站式解析代謝重編程，適配疾病模型、藥物篩選、基因干預(yù)研究

二、實(shí)驗(yàn)全流程（配圖+規(guī)范來(lái)源）

1. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

• Seahorse XFe24傳感卡水合孵育12–16 h

• 小鼠禁食14–16 h（可選，降低內(nèi)源糖干擾）

• 配制aCSF、線粒體抑制劑、瓊脂糖支撐塊

圖1. 瓊脂糖塊制備

制備邊長(zhǎng)約為1 cm的瓊脂糖立方體。

2. 腦組織分離與振動(dòng)切片

頸椎脫臼處死→快速取腦（30–60 s內(nèi)完成）→去除小腦與腦干→冰上aCSF?蔗糖平衡→振動(dòng)切片（250 μm）。

圖2. 腦切片制備流程

(A) 振動(dòng)切片機(jī)的實(shí)驗(yàn)設(shè)置。(B) 將剛從顱骨分離出的大腦中的小腦和腦干取出并棄置。(C) 用紙巾輕輕擦拭大腦底部表面以去除多余液體，隨后將大腦固定在載玻片上。(D) 在大腦后方放置一塊瓊脂糖支撐塊，為切片過(guò)程提供結(jié)構(gòu)支撐。(E) 進(jìn)行大腦切片操作。(F) 使用轉(zhuǎn)移移液管，將含有目標(biāo)區(qū)域的腦切片從振動(dòng)切片機(jī)的緩沖托盤中取出，置于預(yù)先盛有腦脊液-蔗糖溶液的培養(yǎng)皿中。

3. 腦片穿孔與上板

使用1 mm活檢穿孔器取目標(biāo)腦區(qū)（如海馬）→轉(zhuǎn)移至Islet Capture微孔板→網(wǎng)片固定→設(shè)置無(wú)糖/有糖雙組。

圖3. 切片穿ci器的準(zhǔn)備與轉(zhuǎn)移

(A) 將1毫米厚不銹鋼活檢穿ci器放入培養(yǎng)皿中，輕柔按壓于腦切片的目標(biāo)區(qū)域上方。(B) 采集雙側(cè)大腦齒狀回組織后的腦切片圖像。(C) 直接將穿刺所得組織塊注入XFe 微孔板的孔中，并使用活檢穿ci器調(diào)整穿ci器位置，確保其位于各孔中心。

圖4. XFe24胰島捕獲微孔板的布局及網(wǎng)狀插入物的放置

(A)XFe24胰島捕獲微孔板中的四個(gè)背景校正孔（A1、B4、C3和D6）應(yīng)僅含有腦脊液（無(wú)穿刺孔）。(B)使用精細(xì)的鑷子將網(wǎng)狀插入物輕柔地置于XFe24胰島捕獲微孔板各孔的穿刺孔上方，使穿刺孔位于每個(gè)孔的中心。

4. Seahorse代謝表征（約5小時(shí)）

依次注射：BSA?油酸 → 寡霉素 → FCCP → kmsA，全自動(dòng)獲取完整代謝曲線。

? 實(shí)驗(yàn)結(jié)果專業(yè)解讀

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)多底物、多抑制劑時(shí)序干預(yù)，可拆解小鼠腦組織線粒體呼吸功能與糖脂代謝偏好，結(jié)合有糖/無(wú)糖雙實(shí)驗(yàn)組，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的腦代謝表型分析：

1. 脂肪酸代謝能力分析：無(wú)糖蔗糖體系下加入BSA-油酸，可排除葡萄糖干擾，單獨(dú)檢測(cè)腦組織脂肪酸氧化供能水平，判斷腦部是否存在脂代謝功能損傷、底物利用障礙。

2. 線粒體功能分層解析：寡霉素抑制ATP合酶，可檢測(cè)ATP偶聯(lián)呼吸與質(zhì)子泄漏；FCCP解偶聯(lián)后測(cè)定線粒體呼吸能力與呼吸儲(chǔ)備；kmsA阻斷呼吸鏈，鎖定非線粒體呼吸基線，完整覆蓋腦組織基礎(chǔ)呼吸、ATP生成、top呼吸、備用呼吸四大核心代謝參數(shù)。

3. 代謝重編程判定：對(duì)比有糖、無(wú)糖條件下的OCR與ECAR差異，可區(qū)分腦組織的代謝偏好。如文獻(xiàn)經(jīng)典結(jié)果所示，ApoE4致病基因型小鼠海馬組織會(huì)出現(xiàn)葡萄糖代謝代償性增強(qiáng)、脂肪酸氧化能力顯著下降，同時(shí)有氧糖酵解水平升高，呈現(xiàn)典型的病理性代謝重編程特征。

4. 糖酵解水平定量：以無(wú)糖組ECAR為基線，可精準(zhǔn)扣除非糖酵解性pH干擾，特異性量化葡萄糖誘導(dǎo)的有氧糖酵解速率，適配神經(jīng)炎癥、腦衰老、神經(jīng)退行性病變的代謝機(jī)制研究。

圖5. 在無(wú)血糖（蔗糖）和血糖（葡萄糖）條件下，急性海馬切片穿刺的代表性耗氧率（OCR）。FA：脂肪酸；Oligo.：寡霉素；AA：kmsA。

圖6. ApoE4可降低小鼠海馬區(qū)的脂肪酸氧化并促進(jìn)葡萄糖代謝。

(A) 含10 mM葡萄糖但無(wú)外源性脂肪酸的海馬切片線粒體耗氧率（OCR）；

(B) 無(wú)外源性葡萄糖或脂肪酸的海馬切片線粒體OCR；

(C) 含150 mM油酸-BSA但無(wú)葡萄糖的海馬切片線粒體OCR；

(D) 含10 mM葡萄糖加150 mM油酸-BSA的海馬切片線粒體OCR；

(E) 無(wú)外源性脂肪酸的海馬切片細(xì)胞外酸化速率（ECAR）；

(F) 含外源性脂肪酸的海馬切片 ECAR 。

三、關(guān)鍵質(zhì)控與常見問(wèn)題

1. 孔間變異大：打孔器限用≤4次，僅選用完整無(wú)損傷穿孔

2. 對(duì)抑制劑無(wú)響應(yīng)：檢查加藥口，提前滴定濃度

3. 無(wú)糖組OCR/ECAR偏高：小鼠禁食+全程使用無(wú)糖aCSF

4. 腦片活性下降：總操作時(shí)間≤7–8 h，氧飽和aCSF保存

配套產(chǎn)品推薦｜實(shí)驗(yàn)一站式配齊

1. 核心檢測(cè)平臺(tái)

Agilent Seahorse XFe24 細(xì)胞能量代謝分析儀

• 24孔通量，同步OCR+ECAR檢測(cè)

• 4通道自動(dòng)加藥，兼容細(xì)胞、腦片、組織塊、類器官等多類型樣本，適配**組織特異性代謝研究**

• Wave軟件一鍵導(dǎo)出呼吸/糖酵解參數(shù)

2. 專用耗材

Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak（貨號(hào)103518?100）

• 含傳感卡、Islet Capture微孔板、校準(zhǔn)液

• 凹陷孔+網(wǎng)片設(shè)計(jì)，固定腦片不漂浮

3. 關(guān)鍵試劑

• 線粒體抑制劑：Oligomycin A、FCCP、Antimycin A（線粒體壓力試劑盒）

• 無(wú)脂肪酸BSA、BSA?油酸復(fù)合物

• aCSF全套組分：NaCl、KCl、CaCl?·2H?O、HEPES等

4. 組織制備設(shè)備

振動(dòng)切片機(jī)

• 切片厚度：250 μm

• 低溫低振幅，較好保護(hù)腦片活性

1 mm 不銹鋼活檢穿孔器

• 精準(zhǔn)取材，減少機(jī)械損傷，保證樣品均一性