表觀遺傳學(xué)是解析生命現(xiàn)象調(diào)控機(jī)制的重要領(lǐng)域之一，其中蛋白質(zhì)與DNA的相互作用（如組蛋白修飾、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合），在很大程度上影響著基因表達(dá)的時空特異性，也是連接基因型與表型的重要紐帶，廣泛參與各類生命活動的調(diào)控進(jìn)程。隨著表觀基因組學(xué)技術(shù)不斷迭代，2019年開發(fā)的CUT&Tag技術(shù)憑借原位靶向切割、低樣本需求、高靈敏度、低背景噪音等核心優(yōu)勢，可高效解析蛋白質(zhì)-DNA相互作用，已成為表觀基因組學(xué)研究的主流技術(shù)工具。

什么是CUT&Tag？

CUT&Tag全稱Cleavage Under Targets and Tagmentation，是一種新型的蛋白-DNA互作研究技術(shù)，可廣泛應(yīng)用于組蛋白修飾、轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)重塑蛋白等全基因組結(jié)合位點分析，適用于動植物、細(xì)胞及組織等多種樣本類型。

技術(shù)原理

在CUT&Tag實驗中，先將細(xì)胞（核）固定在刀豆蛋白磁珠（ConA 磁珠）上，加入特異性一抗識別并結(jié)合目標(biāo)蛋白（如轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白修飾標(biāo)記），再通過二抗放大信號。抗體復(fù)合物與ProteinA/G融合的Tn5轉(zhuǎn)座酶（pAG-Tn5）結(jié)合，將轉(zhuǎn)座酶精準(zhǔn)定位至目標(biāo)蛋白結(jié)合的DNA區(qū)域。Tn5轉(zhuǎn)座酶激活后，對目標(biāo)蛋白結(jié)合的DNA進(jìn)行片段化切割，同時在切割位點兩端添加測序接頭，經(jīng)PCR擴(kuò)增后即可完成文庫制備。

CUT&Tag技術(shù)流程圖

技術(shù)優(yōu)勢

高效簡便

無需超聲破碎染色質(zhì)，實驗流程從ChIP-seq的3-5天縮短至1-2天，建庫一步完成。

低樣本量

樣本用量顯著降低，適配微量組織與珍貴稀缺樣本。

高信噪比

背景信號低，特異性結(jié)合區(qū)域富集度高，減少非特異性結(jié)合帶來的干擾。

溫和反應(yīng)條件

避免劇烈的染色質(zhì)破碎和復(fù)雜的純化步驟，更好保留蛋白質(zhì)-DNA天然相互作用。

植物領(lǐng)域應(yīng)用場景

1.       轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控研究：鑒定轉(zhuǎn)錄因子在全基因組的結(jié)合位點，解析其對下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式，構(gòu)建關(guān)鍵生物學(xué)過程的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.       組蛋白修飾表觀調(diào)控研究：分析組蛋白修飾（如甲基化、乙?；龋┰谌旧|(zhì)上的分布情況，了解組蛋白修飾與基因表達(dá)、染色質(zhì)狀態(tài)之間的關(guān)系。

3.       逆境響應(yīng)與抗病機(jī)制研究：挖掘非生物脅迫、生物脅迫下蛋白-DNA互作的動態(tài)變化與異常特征，闡明抗逆、抗病的分子調(diào)控機(jī)理，為作物分子育種、病害綠色防控提供靶點與理論支撐。

4.       生長發(fā)育研究：解析種子萌發(fā)、開花結(jié)實、器官形成等不同發(fā)育階段的蛋白-DNA互作動態(tài)，揭示生長發(fā)育調(diào)控的分子基礎(chǔ)。

文獻(xiàn)案例

CUT&Tag技術(shù)在棉花鹽脅迫下H3K27me3表觀調(diào)控研究中的應(yīng)用

文獻(xiàn)題目：H3K27me3-mediated chromatin remodeling governs salt tolerance in cotton via Na+/K+ homeostasis modulation

核心研究結(jié)果：

本研究通過CUT&Tag技術(shù)解析了鹽脅迫下棉花根系H3K27me3的全基因組分布特征，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫會顯著降低該組蛋白修飾水平，并結(jié)合RNA-seq數(shù)據(jù)篩選出36個表達(dá)量與H3K27me3修飾水平呈負(fù)相關(guān)的基因。結(jié)合后續(xù)實驗，進(jìn)一步鎖定GhNCED3、GhTIFY9兩個關(guān)鍵耐鹽基因，并證實其可通過調(diào)控活性氧積累與鈉鉀離子平衡正向增強棉花耐鹽能力。

該研究依托CUT&Tag精準(zhǔn)揭示了H3K27me3介導(dǎo)的表觀調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，填補棉花鹽脅迫表觀機(jī)制空白，為耐鹽棉花分子育種提供關(guān)鍵靶標(biāo)與理論依據(jù)。

圖1. 對照與鹽處理條件下棉花根系H3K27me3的特征。（A）對照（Mock）與鹽處理下根系組織H3K27me3富集水平的Westernblot分析。（B）H3K27me3相對灰度值。（C）CUT&Tag實驗中對照與鹽處理根系檢測到的峰數(shù)。（D、E）對照（D）與鹽處理（E）根系H3K27me3峰的基因組分布，展示峰在啟動子、基因區(qū)、基因間區(qū)及其他基因組元件中的占比。（F）對照與鹽處理根系H3K27me3的全基因組覆蓋度。（G）對照與鹽處理根系中H3K27me3在所有棉花基因上的分布（基因體上游3kb至下游3kb）。

圖2. 鹽脅迫對鹽響應(yīng)基因H3K27me3修飾及表達(dá)水平的影響。（A）對照與鹽處理根系中GhNCED3的H3K27me3修飾圖譜。（B）對照與鹽處理根系中GhTIFY9的H3K27me3修飾圖譜。（C）采用CUT&Tag-qPCR檢測GhNCED3與GhTIFY9的H3K27me3水平。（D）采用RNA-seq與qRT-PCR分析GhNCED3和GhTIFY9的表達(dá)水平。