摘 要：簡(jiǎn)介比濁法和活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定菌液濃度的操作步驟和優(yōu)缺點(diǎn)，將比濁法與活菌計(jì)數(shù)法相結(jié)合，測(cè)定了常見(jiàn)模式菌株比濁度對(duì)應(yīng)的活菌計(jì)數(shù)濃度，為菌種濃度的預(yù)估提供一個(gè)快速，準(zhǔn)確，便捷的方法。

　　關(guān)鍵詞：菌液濃度;活菌計(jì)數(shù);比濁度

　　在微生物檢驗(yàn)工作中，比如藥品微生物限度檢查方法驗(yàn)證、防腐效力測(cè)試、消毒液消毒效果驗(yàn)證、培養(yǎng)基適用性檢查等等，常常需要加入一定濃度的菌懸液，菌液濃度過(guò)高或過(guò)低都將影響測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此控制菌液濃度是必要且關(guān)鍵的一步。測(cè)定菌液濃度的方法一般有三種，其一為活菌計(jì)數(shù)法，此法能準(zhǔn)確判斷菌液濃度，是目前國(guó)內(nèi)的仲裁法，但是該法需要培養(yǎng)后計(jì)數(shù)，有明顯的滯后性;其二為顯微鏡觀察法，該方法適用于菌體較大的菌種濃度的測(cè)定，如霉菌和酵母菌，具有方便快捷的優(yōu)點(diǎn)，但不適用于菌體細(xì)小的菌種濃度的測(cè)定，有較大的局限性;三為比濁法，此法能快速地判斷菌液濃度，但結(jié)果為粗略的估計(jì)值，不同大小的菌種其形成的光密度不同，因此同一個(gè)比濁度，不同的菌結(jié)果差異較大，準(zhǔn)確性不高。

　　本文具體介紹將比濁法和活菌計(jì)數(shù)法相結(jié)合的測(cè)定方法，測(cè)定了常見(jiàn)模式菌株1麥?zhǔn)媳葷岫?MCFARLAND)的菌液濃度，用于指導(dǎo)日常微生物檢測(cè)工作中菌液濃度的快速、準(zhǔn)確測(cè)定，具有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。

　　一、菌種及菌液的制備

　　1.菌種

　　(Staphylococcus aureus ATCC 6538)

　　銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027)

　　大腸埃希菌(Escherichia coli ATCC 8739)

　　枯草芽孢桿菌( Bacillus subtilisATCC 6633)

　　(Salmonella paratyphiCMCC(B)50094)

　　白色念珠菌(Candida albicans ATCC 10231)

　　黑曲霉(Aspergillusniger ATCC 16404)

　　以上菌種從廣東省微生物菌種保藏中心采購(gòu)，經(jīng)復(fù)蘇兩代至五代內(nèi)使用。

　　2.菌液的制備

　　(1)將、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、的凍干管封口端(即遠(yuǎn)離凍干粉的一端)在火焰上分別灼燒后，迅速滴加幾滴滅菌水，使灼燒處管口裂口后，在生物安全柜內(nèi)用滅菌鑷子輕輕掰開(kāi)裂口，分別用0.5mL TSB溶解凍干菌種，然后將溶解后的凍干菌株全部轉(zhuǎn)移到10mL TSB中，置36±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24小時(shí)，此為代菌種。在生物安全柜內(nèi)分別用無(wú)菌接種環(huán)挑取1接種環(huán)代上述菌懸液分別劃線接種于TSA中然后置于36±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24小時(shí)，此為第二代菌種，備用。

　　(2)將白色念珠菌凍干管封口端在火焰上灼燒后，迅速滴加幾滴滅菌水，使灼燒處管口裂口后，在生物安全柜內(nèi)用滅菌鑷子輕輕掰開(kāi)裂口，用0.5mL改良馬丁液體培養(yǎng)基溶解凍干菌種，然后將溶解后的凍干菌株全部轉(zhuǎn)移到10mL 改良馬丁液體培養(yǎng)基中，置28±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48小時(shí)，此為代菌種。在生物安全柜內(nèi)無(wú)菌接種環(huán)挑取1接種環(huán)代菌懸液劃線接種于改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中。將新鮮接種的改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基置28±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48小時(shí)，此為第二代菌種，備用。

　　(3)將黑曲霉凍干管封口端在火焰上灼燒后，迅速滴加幾滴滅菌水，使灼燒處管口裂口后，在生物安全柜內(nèi)用滅菌鑷子輕輕掰開(kāi)裂口，用0.5mL含0.05%吐溫80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液溶解凍干菌種，然后將溶解后的凍干菌株劃線接種到改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，置28±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7天，此為代菌種。在生物安全柜內(nèi)，用無(wú)菌接種環(huán)挑取1接種環(huán)代黑曲霉劃線接種于改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中。然后置28±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7天，此為第二代菌種。向第二代黑曲霉菌種管內(nèi)加入5ml含0.05%吐溫80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，用無(wú)菌接種環(huán)將孢子洗脫，吸出孢子懸液(用管口帶有薄的無(wú)菌棉花或紗布能過(guò)濾菌絲的無(wú)菌毛細(xì)吸管)至無(wú)菌試管內(nèi)，備用。

　　二、培養(yǎng)基和儀器

　　1.培養(yǎng)基

　　(1)商品培養(yǎng)基。

　　胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)瓶裝顆粒培養(yǎng)基

　　胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)

　　改良馬丁液體培養(yǎng)基

　　改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基

　　0.5%無(wú)菌T.T.C

　　以上培養(yǎng)基從廣東環(huán)凱微生物科技有限公司采購(gòu)商品培養(yǎng)基，按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)配制，滅菌后備用，其中TSA在使用前每100mL培養(yǎng)基加入1mL0.5%無(wú)菌T.T.C以便于細(xì)菌菌落的觀察。

　　(2)按配方配制的培養(yǎng)基。

　　0.85%氯化鈉

　　0.9%氯化鈉

　　含0.05%吐溫80的0.9%氯化鈉

　　以上培養(yǎng)基按配方配制，滅菌后備用。

　　2.儀器

　　生物安全柜(型號(hào)：SBSC1600ⅡB2)

　　恒溫培養(yǎng)箱(36±1℃，28±2℃)

　　麥?zhǔn)媳葷醿x(產(chǎn)品貨號(hào)：WGZ-XT，生產(chǎn)商：豐臨)

細(xì)菌濁度儀WGZ-XT

　　漩渦混合器(型號(hào)：QA-1)

　　三、菌種比濁度的測(cè)定及調(diào)節(jié)

　　1.按儀器使用說(shuō)明書(shū)操作，用標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁軝z定儀器，當(dāng)不同濃度的麥?zhǔn)媳葷峁茏x數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁軜?biāo)定的值在誤差允許范圍內(nèi)時(shí)，方可進(jìn)行下一步驟。

　　2.用0.85%無(wú)菌氯化鈉作為空白，調(diào)零。

　　3.分別用無(wú)菌接種環(huán)挑取1.2.1和1.2.2的平板上菌落適量，分別在裝有5mL 0.85%氯化鈉的50mL錐形瓶瓶壁上將菌分散(蘸取少量氯化鈉后在瓶壁上來(lái)回劃線，以便將菌分散后使之易于混勻)，然后用混合器將菌液混勻備用。

　　4.測(cè)定菌液比濁度，用相應(yīng)菌種的菌落或氯化鈉調(diào)節(jié)菌液的濃度，使菌液比濁度讀數(shù)約為1MCFARLAND。

　　四、活菌計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)各菌種1 MCFARLAND的菌含量

　　1.、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行操作。用0.85%無(wú)菌氯化鈉作為稀釋劑，10倍梯度逐級(jí)稀釋至10-7，分別依次測(cè)定每種菌10-5～10-7三個(gè)稀釋倍數(shù)的菌落數(shù)。用移液槍及滅菌移液槍頭各吸取1mL注入滅菌平皿中，每種菌每個(gè)梯度制備2個(gè)平行。注入約20mL，45℃～50℃的TSA培養(yǎng)基，隨即轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使樣品與培養(yǎng)基充分混合均勻，待培養(yǎng)基凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h，然后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。先用肉眼觀察，必要時(shí)可用放大鏡，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，記下各平皿的菌落數(shù)后，求出每種菌的平均菌落數(shù)，換算成每種菌1 MCFARLAND的菌含量。

　　2.白色念珠菌和黑曲霉在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行操作，白色念珠菌用0.85%無(wú)菌氯化鈉作為稀釋劑，黑曲霉用0.9%無(wú)菌氯化鈉作為稀釋劑，10倍梯度逐級(jí)稀釋至10-6，每種菌分別測(cè)定10-4～10-6三個(gè)稀釋倍數(shù)的菌落數(shù)。用移液槍及滅菌移液槍頭各吸取1mL注入滅菌平皿，每種菌每個(gè)梯度制備2個(gè)平行。注入約20mL，45℃～50℃的改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基，隨即轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使樣品與培養(yǎng)基充分混合均勻，待培養(yǎng)基凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置28℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72h后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。先用肉眼觀察，必要時(shí)可用放大鏡，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，記下各平皿的菌落數(shù)后，求出每種菌的平均菌落數(shù)，換算成每種菌1 MCFARLAND的菌含量。

　　五、結(jié)果與討論

　　每種菌獨(dú)立重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)每種菌1MCFARLAND所含的平均菌落數(shù)。結(jié)果如下表：

　　由表1可以看到：、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、、白色念珠菌以及黑曲霉每1MCFARLAND采用活菌計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)所得的菌液含量具有良好的重現(xiàn)性，三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定的菌液含量相對(duì)偏差小于50%。菌液的比濁度的菌液體的大小有有關(guān)，菌體越大，相同比濁度的菌液含量越少。

　　六、結(jié)論

　　通過(guò)本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，菌液含量(CFU/mL)與菌液的比濁度(MCFARLAND)有良好的相關(guān)性，可將實(shí)驗(yàn)用菌懸液調(diào)節(jié)至1MCFARLAND，通過(guò)活菌計(jì)數(shù)法確定實(shí)驗(yàn)用菌懸液的含量，以便較準(zhǔn)確的預(yù)估實(shí)驗(yàn)用菌株濃度及所需要稀釋的級(jí)別。用平板制備的菌落，可采用適宜的稀釋劑作為比濁儀的空白對(duì)照，調(diào)零。此方法特別適用于枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞桿菌等在液體培養(yǎng)基上易形成塊狀或絮狀物等不易打散的菌液的計(jì)數(shù)。若采用液體培養(yǎng)基增菌的菌液則用相應(yīng)的液體培養(yǎng)基作為比濁儀的空白對(duì)照，調(diào)零。

　　由于實(shí)驗(yàn)室間條件差異;培養(yǎng)基產(chǎn)地、批號(hào)不同;操作人員與系統(tǒng)誤差等原因，同一菌種比濁度對(duì)應(yīng)的菌液含量會(huì)有一定差異，建議在同一實(shí)驗(yàn)室一旦有因素變化，應(yīng)再重新確定菌種比濁度對(duì)應(yīng)的菌液含量。

　　參考文獻(xiàn)：

　　[1]朱艷靜，李宇.測(cè)定菌體濃度的簡(jiǎn)便方法[J].上海市工業(yè)微生物研究所，2002，第36卷第4期：47-49.

　　[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[ M ].四部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版，2015： 1105.

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