ELISA試劑盒中酶底物顯色反應(yīng)的常見類型，是基于標(biāo)記酶的種類差異形成的不同顯色體系，不同類型的顯色反應(yīng)在顏色變化、靈敏度、適用場(chǎng)景上有明確區(qū)分，結(jié)合此前長(zhǎng)期深耕ELISA實(shí)驗(yàn)全流程優(yōu)化、性能質(zhì)控的相關(guān)實(shí)驗(yàn)背景，詳細(xì)拆解如下：

一、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記對(duì)應(yīng)的顯色反應(yīng)類型

HRP是當(dāng)前ELISA試劑盒中應(yīng)用zuiguang泛的標(biāo)記酶，對(duì)應(yīng)的底物顯色反應(yīng)類型占市場(chǎng)上ELISA試劑盒的80%以上，常見的有3種核心類型：

TMB顯色體系?

這是目前臨床和科研場(chǎng)景中使用占比最高的HRP底物類型，全稱3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺。在HRP的催化作用下，TMB會(huì)失去電子生成藍(lán)色的陽(yáng)離子自由基，反應(yīng)過(guò)程中溶液從無(wú)色透明逐漸變?yōu)槊髁恋奶焖{(lán)色，顏色深淺和待測(cè)靶標(biāo)的濃度正相關(guān)。加入2M的硫酸終止液后，藍(lán)色產(chǎn)物會(huì)進(jìn)一步質(zhì)子化，轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的黃色終產(chǎn)物，在450nm波長(zhǎng)下有最高的光吸收峰，酶標(biāo)儀讀數(shù)的線性范圍極寬。

該顯色體系的核心優(yōu)勢(shì)是無(wú)致癌性、背景值極低、顯色反應(yīng)速度適中，37℃避光孵育10~15分鐘就能達(dá)到理想的信號(hào)強(qiáng)度，是定量類ELISA試劑盒的首要選擇顯色體系，幾乎所有的雙抗夾心法大分子蛋白定量試劑盒都采用TMB顯色體系。

OPD顯色體系?

全稱鄰苯二胺，是早期HRP標(biāo)記ELISA的主流底物。在HRP催化下，OPD會(huì)被氧化生成深橙色的終產(chǎn)物，最大吸收波長(zhǎng)在492nm，未加終止液時(shí)的顯色顏色為亮橙色，加入終止液后轉(zhuǎn)為棕黃色。

該顯色體系的顯色產(chǎn)物顏色鮮亮、肉眼辨識(shí)度jigao，早期的定性篩查類ELISA試劑盒大量使用，但由于OPD本身具有明確的致癌性，且顯色產(chǎn)物見光后極不穩(wěn)定，孵育超過(guò)20分鐘就會(huì)出現(xiàn)明顯的背景升高，目前已經(jīng)逐步被TMB體系替代，僅在部分傳統(tǒng)的手工定性檢測(cè)試劑盒中還有少量應(yīng)用。

ABTS顯色體系?

全稱2,2'-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽，在HRP催化下直接生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色可溶性產(chǎn)物，不需要額外終止反應(yīng)，最大吸收波長(zhǎng)在405nm。

該顯色體系的反應(yīng)速度極快，背景值極低，且顯色產(chǎn)物的穩(wěn)定性jiqiang，室溫下放置24小時(shí)吸光度值變化幅度小于5%，特別適合用于抗體親和力篩選、酶活性動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)類的ELISA實(shí)驗(yàn)，缺點(diǎn)是整體靈敏度略低于TMB體系，不適合低豐度微量靶標(biāo)的高靈敏度檢測(cè)。

二、堿性磷酸酶（AP/ALP）標(biāo)記對(duì)應(yīng)的顯色反應(yīng)類型

堿性磷酸酶是第二大主流ELISA標(biāo)記酶，對(duì)應(yīng)的顯色體系整體背景更低、穩(wěn)定性更強(qiáng)，在部分高要求的臨床診斷試劑盒中廣泛使用：

PNPP顯色體系?

全稱對(duì)硝基苯磷酸二鈉，是AP標(biāo)記ELISA的zui常用底物。在堿性磷酸酶的催化作用下，PNPP水解生成亮黃色的對(duì)硝基產(chǎn)物，最大吸收波長(zhǎng)在405nm，反應(yīng)全程在pH9.8的堿性緩沖體系中進(jìn)行，不需要避光孵育，顯色速度溫和，37℃孵育30~60分鐘后可以獲得jijia的信號(hào)線性。

該顯色體系的核心優(yōu)勢(shì)是幾乎沒有非特異性背景顯色，批內(nèi)CV值可以控制在2%以內(nèi)，遠(yuǎn)低于HRP體系的常規(guī)水平，特別適合高重復(fù)性要求的臨床生化類定量ELISA試劑盒，缺點(diǎn)是顯色反應(yīng)速度偏慢，整體檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)比TMB體系長(zhǎng)一倍以上。

AMPPD化學(xué)發(fā)光顯色體系?

這是AP標(biāo)記的超高靈敏度化學(xué)發(fā)光底物，屬于ELISA的增強(qiáng)發(fā)光顯色類型，在堿性磷酸酶的催化下，AMPPD會(huì)持續(xù)穩(wěn)定地發(fā)射出477nm的冷光信號(hào)，不需要酶標(biāo)儀讀取吸光度，直接用化學(xué)發(fā)光儀讀取相對(duì)光單位RLU值。

該顯色體系的靈敏度比普通可見光顯色體系高2~3個(gè)數(shù)量級(jí)，zuidi檢出限可以達(dá)到pg/mL級(jí)別，可以滿足超微量細(xì)胞因子、腫瘤標(biāo)志物的高靈敏度檢測(cè)要求，是目前gaoduan全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光ELISA平臺(tái)的主流顯色方案。

三、其他小眾標(biāo)記酶對(duì)應(yīng)的顯色反應(yīng)類型

除了HRP和AP兩大主流體系外，還有部分特殊場(chǎng)景的ELISA試劑盒會(huì)使用小眾標(biāo)記酶的顯色體系：

β-半乳糖苷酶顯色體系?

以ONPG（鄰硝基苯基-β-D-半乳糖苷）作為底物，在β-半乳糖苷酶的催化下生成亮黃色產(chǎn)物，最大吸收波長(zhǎng)420nm，該體系的非特異性吸附極低，幾乎沒有內(nèi)源性酶干擾，特別適合復(fù)雜基質(zhì)樣本（如血清、組織勻漿）中的低豐度靶標(biāo)檢測(cè)，多用于科研級(jí)別的高難度ELISA實(shí)驗(yàn)。

TMB沉淀型顯色體系?

屬于HRP標(biāo)記的衍生顯色類型，使用不溶性的TMB底物，在HRP催化下生成深藍(lán)色的不溶性沉淀，直接附著在96孔板的孔底，不需要終止液，也不需要酶標(biāo)儀讀數(shù)，直接通過(guò)肉眼觀察沉淀的深淺就能完成定性判讀，是各類膠體金之外的快速定性ELISA檢測(cè)試劑條的主流顯色方案，廣泛用于食品安全快速篩查、現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)類試劑盒。

不同類型的顯色反應(yīng)，直接決定了ELISA試劑盒的靈敏度、檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)、適用場(chǎng)景，在試劑盒研發(fā)選型階段，需要根據(jù)靶標(biāo)的豐度、檢測(cè)的精度要求、判讀方式需求，選擇最適配的顯色體系，才能zui大化試劑盒的綜合性能。