水果中相當(dāng)部分的干物質(zhì)是有機(jī)酸,它往往比許多其他物質(zhì)更多地決定水果的特殊味道,并在食品營養(yǎng)學(xué)中占有重要位置，有機(jī)酸除了具有抗生素作用外，還具有其它幾種作用，包括降低消化物pH和增加胰腺分泌。不同種類的水果中有機(jī)酸的種類和含量差別很大,故在現(xiàn)代食品工業(yè)中對有機(jī)酸的研究已愈加重視和普及。液相色譜法操作簡便、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好,可同時(shí)定量測定多種有機(jī)酸,但液相色譜法測定水果中有機(jī)酸的報(bào)道中有機(jī)酸種類及水果品種相差較多，尤其是草莓與油桃這兩類水果未見報(bào)道。

考慮到***體成分復(fù)雜,從保護(hù)色譜柱及提高分離效果的目的出發(fā),本文將卡瑞(Carrez)試劑作為水果樣品凈化劑應(yīng)用于水果中有機(jī)酸的測定.

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

Agilent1100液相色譜儀(含四元泵、柱溫箱、可變波長紫外檢測器、手動進(jìn)樣器、定量環(huán)等).水相針式過濾頭,去離子水(電阻率可達(dá)18MΩ·cm).草酸、酒石酸、維生素C(抗壞血酸)、L2蘋果酸、乳酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸(丁二酸)等有機(jī)酸對照品均為分析純試劑.甲醇為色譜純試劑,及磷酸為分析純試劑.流動相經(jīng)0.45μm濾膜過濾.樣品為市售新鮮水晶梨、碭山梨、蘋果梨、新疆香梨、新疆貢梨、富士蘋果、草莓、油桃等

1.2對照品及供試品溶液的制備

對照品溶液的制備:分別稱取適量各有機(jī)酸對照品(0.5～1.5g,至0.1mg),分別用流動相緩沖溶液溶解并定容于100mL容量瓶中,作為有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)貯備液.使用時(shí)各取1.00mL配制成有機(jī)酸的混合標(biāo)準(zhǔn)液,再將混合標(biāo)準(zhǔn)液在25mL容量瓶中用流動相緩沖溶液稀釋成不同的濃度梯度,即上述溶液濃度的0.2,0.4,0.6,0.8,1.0倍。

供試品溶液的制備:榨汁法制樣(選果2削皮2切片2榨汁2過濾),所得果汁準(zhǔn)確稱取3g左右,加入適量流動相緩沖溶液后,加入Carrez試劑I和II各0.1mL,再用流動相緩沖溶液定容于25mL容量瓶中,靜置

1.3色譜條件

色譜柱:EclipseXDB2C8柱(4.6×150mm,5μm);流動相A:甲醇,流動相B:0.01mol·L-12磷酸緩沖液(pH=2.6);梯度洗脫程序:0～2.4min內(nèi),由7.5%A變化為1.5%A,此后流動相A的比例不變.流動相流速:0.5mL·min-1;進(jìn)樣體積:20μL;紫外檢測波長:214nm;柱溫:25°

2結(jié)果與討論

2.1色譜條件的優(yōu)化

2.1.1檢測波長的確定

對每種有機(jī)酸的吸光度進(jìn)行波長掃描,發(fā)現(xiàn)這8種有機(jī)酸的zui大吸收波長在204～243nm之間.并經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定214nm為檢測波長。

2.1.2流動相的選擇及其pH值的確定

甲醇2水系統(tǒng)或甲醇2磷酸鹽緩沖系統(tǒng)是在C8或C18柱中應(yīng)用zui廣的流動相,經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用甲醇2磷酸鹽緩沖系統(tǒng)更適合使用C8柱分析有機(jī)酸.由于流動相的pH值對有機(jī)酸的保留時(shí)間有較大影響,因此,通過調(diào)節(jié)流動相的pH值(pH2.3,2.5,2.6,2.7,2.8)對8種有機(jī)酸進(jìn)行檢測,當(dāng)pH值較小時(shí)草酸與酒石酸分離效果很好,但富馬酸和琥珀酸分離效果不佳;當(dāng)pH值較大時(shí)結(jié)果相反.pH值為2.6時(shí)分離效果較好.

2.1.3流動相流速

實(shí)驗(yàn)分別考察了0.2,0.5,0.8,1.0mL·min-14個(gè)條件.流速為0.5mL·min-1時(shí),色譜分離效果.

2.1.4流動相的配比

分別考察了等度洗脫(甲醇含量分別為1%,2%,3%,5%,6%)及梯度洗脫兩種情況.發(fā)現(xiàn)在等度洗脫中,當(dāng)甲醇比例較大時(shí)草酸與酒石酸分離較好,但檸檬酸與乳酸、富馬酸和琥珀酸分離效果不佳;當(dāng)甲醇比例較小時(shí)分離情況相反.且每種甲醇比例均不能使維生素C與L2蘋果酸得到有效分離,說明等度洗脫不能滿足分離要求.根據(jù)上述經(jīng)驗(yàn),經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)嘗試了各種梯度后,發(fā)現(xiàn)當(dāng)梯度為0～2.4min內(nèi),流動相中甲醇的比例由7.5%變化為1.5%,此后流動相A的比例不變時(shí),維生素C與L2蘋果酸分離較好并能夠進(jìn)行定量分析,其他有機(jī)酸也能達(dá)到分離的目的。

2.2線性關(guān)系、檢出限、精密度及回收率

將混合標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸的系列工作溶液,按上述色譜條件依次由低濃度向高濃度經(jīng)0.45μm針頭過濾后進(jìn)樣20μL,采集數(shù)據(jù).分別以各組分的峰面積y對標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度x(mg·mL-1)進(jìn)行線性回歸分析,8種有機(jī)酸的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表1。

準(zhǔn)確稱取相同樣品(水晶梨)兩份,其中1份加入已知量有機(jī)酸標(biāo)樣,另一份不加,每份樣品平行測定3次,利用增量法計(jì)算回收率,并計(jì)算變異系數(shù)。

由表1可知,有機(jī)酸回歸方程的相關(guān)系數(shù)大于0.9995,線性良好.本法的回收率在93.01%～101.79%之間,變異系數(shù)在4%以內(nèi),精密度較高,結(jié)果準(zhǔn)確。

2.3樣品制備方法的探討

2.3.1關(guān)于榨汁制樣法與水果中維生素C含量的測定

采用榨汁法測定水果中有機(jī)酸,未能檢測出水果中的維生C,故懷疑在樣品制備過程中,維生素C被破壞而未能檢測到.本實(shí)驗(yàn)也采用榨汁法制樣并檢測到了維生素C,且效果良好.比較本實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)制樣過程中有明顯不同的一點(diǎn)就是本實(shí)驗(yàn)采用流動相酸性緩沖液定容,選用純水定容.這是由于液體維生素C具有較強(qiáng)的還原性,易受空氣、熱、光等因素影響,但在酸性溶液中較穩(wěn)定.故采用榨汁法制樣,用流動相酸性緩沖液定容,從而實(shí)現(xiàn)了維生素C的檢測。

2.3.2樣品制備中加入Carrez試劑

液相色譜法對樣品的處理要求較高,一方面要求樣品成分盡量簡單以消除基體對測定對象的干擾,另一方面對色譜柱的容量、使用壽命等保護(hù)色譜柱的角度要求進(jìn)柱之前的樣品盡量簡單.而水果原汁樣品往往成分復(fù)雜,基體干擾大,對色譜柱負(fù)擔(dān)重.本實(shí)驗(yàn)從保護(hù)色譜柱及提高分離效果的目的出發(fā),嘗試向水果樣品中加入Carrez試劑,使蛋白質(zhì)、脂肪等雜質(zhì)沉淀。

在含果汁3g左右,欲25mL定容的樣品中加Carrez試劑I和II各0.1mL與不加Carrez試劑的原樣進(jìn)行檢測對比,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,加入Carrez試劑I和II各0.1mL,色譜峰數(shù)及保留時(shí)間基本不變,其有機(jī)酸含量也基本保持不變,即Carrez試劑的加入不影響水果有機(jī)酸含量的測定.如果增加Carrez試劑的加入量(如加入0.25mL),則對樣品中有機(jī)酸的測量產(chǎn)生一定影響,使測量值普遍偏低(富馬酸除外)。

加入Carrez試劑的另一特點(diǎn)就是可以提高有機(jī)酸分析的精密度和回收率,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2.加入Car2rez試劑處理樣品后每種有機(jī)酸的測定精密度均有不同程度的提高,乳酸、檸檬酸、富馬酸的回收率也比不加Carrez試劑時(shí)有了明顯好轉(zhuǎn)。

2.4不同水果有機(jī)酸含量的分析結(jié)果

2.4.1不同梨品種中有機(jī)酸含量

按2.1和2.3中所述的色譜檢測條件和制樣方法,分別測定水晶梨、碭山梨、蘋果梨、新疆香梨、新疆貢梨中的有機(jī)酸.不同品種梨中有機(jī)酸含量見表3。

由表3可知,不同品種梨中各種有機(jī)酸所占的比例基本相同.碭山梨草酸含量低(0.228),維生素C含量較高(0.546).水晶梨雖然草酸含量略高(0.307),但維生素C(0.450)、蘋果酸(1.651)、檸檬酸(1.027)含量較高.蘋果梨中蘋果酸(1.807)與檸檬酸(1.107)含量高,但相應(yīng)的維生素C含量較低(0.323),且草酸含量略高(0.391)。

2.4.2不同水果中有機(jī)酸含量

按2.1和2.3中所述的檢測條件和制樣方法,分別測定草莓、水晶梨、富士蘋果、油桃水果中有機(jī)酸含量見表4。

由表4可知,草莓(0.592)和梨(0.450)中維生素C含量較高,蘋果(2.482)和油桃(3.400)中蘋果酸含量較高.油桃中有機(jī)酸種類zui為豐富,營養(yǎng)全面,且草酸含量低(0.242).梨中維生素C含量高(0.450),草酸含量低(0.307),相對營養(yǎng)價(jià)值zui高.草莓維生素C(0.592)及檸檬酸(7.505)含量,但草酸含量也zui高(1.137),可作為提取維生素C及檸檬酸的原料。

實(shí)驗(yàn)建立了一種液相色譜測定水果中有機(jī)酸類物質(zhì)的方法.使用C8柱,甲醇2磷酸鹽緩沖溶液為流動相,梯度洗脫,在6min內(nèi)較好地分離和定量分析了草莓、梨、蘋果及油桃等水果中8種有機(jī)酸的含量.使用Carrez試劑作為水果樣品凈化劑,不僅可達(dá)到凈化樣品、保護(hù)色譜柱的目的,同時(shí)可以適當(dāng)提高樣品檢測的精密度和回收率.該方法不僅準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性好,而且分析效率高.為定量分析能夠榨成汁的水果中有機(jī)酸類物質(zhì)的含量提供了參考,對水果食品加工及保鮮有一定的實(shí)際意義.用該方法分析了不同品種梨中各有機(jī)酸的含量,結(jié)果顯示不同品種梨中各種有機(jī)酸所占的比例基本相同.幾種水果中油桃含有機(jī)酸種類zui為豐富,草莓中維生素C及檸檬酸含量。