傳統(tǒng)熒光顯微鏡使用熒光物質(zhì)標(biāo)志細(xì)胞中的特定結(jié)構(gòu)，不僅圖像與背景的對(duì)比度增強(qiáng)，而且由于許多熒光顯微鏡的光源使用短波長(zhǎng)的紫外光，大大提高了分辨率。但當(dāng)所觀察的熒光標(biāo)本稍厚時(shí)，傳統(tǒng)熒光顯微鏡一個(gè)難以克服的缺點(diǎn)就顯現(xiàn)出來(lái)：焦平面以外的熒光使得圖片模糊、發(fā)虛，對(duì)比度降低。

圖1. 共聚焦光路

 
       激光共聚焦顯微鏡恰恰是為解決這個(gè)問(wèn)題應(yīng)運(yùn)而生，科學(xué)家在光路中放置一個(gè)Pinhole，利用這個(gè)Pinhole阻擋焦平面以外的熒光（如圖1），提高對(duì)比度！由于對(duì)比度的大大提升，使得通過(guò)共聚焦顯微鏡得到的圖像細(xì)節(jié)更加清晰，因此受到了各個(gè)領(lǐng)域研究者的廣泛青睞！
共聚焦利用Pinhole排除非焦平面光線干擾，提高圖像對(duì)比度的同時(shí)，我們往往忽略了一個(gè)問(wèn)題，那就是：Pinhole實(shí)際上是削弱了熒光信號(hào)的（如圖2）！只不過(guò)共聚焦顯微鏡利用高功率的激光提供了更強(qiáng)能量的激發(fā)光以彌補(bǔ)Pinhole對(duì)熒光信號(hào)的削弱。

圖2. Pinhole對(duì)熒光信號(hào)的削弱作用

 
       對(duì)于固定細(xì)胞，高能量激發(fā)光的影響主要在對(duì)于熒光分子的光漂白作用。而對(duì)于活細(xì)胞不單單是光漂白作用會(huì)影響成像，更加嚴(yán)重的是高能激發(fā)光對(duì)于活細(xì)胞產(chǎn)生的光毒性可能干擾細(xì)胞的生理過(guò)程。
        zui后一點(diǎn)：共聚焦采用點(diǎn)成像的工作模式，成像速度慢，對(duì)于各種動(dòng)態(tài)生理活動(dòng)的觀察時(shí)間分辨率低。