1.構建CaM誘餌質粒

① PCR 擴增CaM基因的開放閱讀框，正向和反向引物分別加接酶切位點。

② 擴增得到的CaM插入t載體( T–CaM) 。

③ T–CaM和pGBKT7 質粒分別雙酶切。

④ 膠回收目的DNA。

⑤ 將CaM連入pGBKT7，構建成表達載體pGBKT-CaM，轉化大腸桿菌DH5α。

⑥ 因pGBKT7含Kan+抗性基因，在Kan+抗性平板上篩選陽性克隆。

⑦ 測序驗證CaM與gal4 DNA 結合功能區(qū)融合，插入序列讀框正確、無堿基突變。

2.pGBKT7 – CaM轉化酵母菌Y2HGold

將pGBKT7- CaM采用PEG/LiAc法轉化酵母菌Y2HGold，涂布于SD – Trp固體培養(yǎng)基上，30° C 3-5天，菌落長出。

進行CaM自激活鑒定及毒性測定。

3.龍須菜高溫脅迫表達cDNA文庫構建

① 設定溫度梯度(26-35°C)和時間梯度(12-72 h)，對龍須菜進行高溫脅迫。

② 提取龍須菜總RNA(RNA提取按照Qiagen試劑盒說明書進行，RNeasy Plant Mini Kit，Qiagen)。

③ 應用SMART技術構建龍須菜高溫脅迫表達cDNA文庫，3’和5’引物分別加接酶切位點。

4.文庫篩選載體構建

將龍須菜高溫脅迫表達文庫cDNA雙酶切，連入同樣雙酶切的AD 克隆質粒pGADT7中，用PEG/LiAc 轉化法將cDNA 文庫質粒轉化到酵母菌Y187中，SD – Leu平板上30 ℃培養(yǎng)3～5 天，菌落長出。

5.酵母交配轉化及陽性克隆的篩選

將酵母菌Y187/ pGADT7-cDNA與酵母菌Y2HGold/pGBKT7- CaM進行酵母交配轉化(Yeast Mating)，SD–Trp/-Leu/Aba/X-α-gal平板上30 ℃培養(yǎng)3～5 天，篩選藍色菌落，再將陽性克隆在SD–Trp/-Leu/-His/-Ade/Aba/X-α-gal平板上進行驗證。

6.陽性克隆質粒的提取和保存

提取陽性克隆酵母菌的質粒，轉化至大腸桿菌E.coli DH5α中，因pGADT7質粒含Amp+ 抗性基因，在Amp+抗性平板上篩選陽性克隆AD- X(X代表陽性克隆中攜帶的龍須菜cDNA，即為初步篩選得到的相互作用蛋白質的cDNA)。

7.陽性克隆的再驗證

pGBKT7 –CaM 與AD–X質粒共轉化酵母菌Y2HGold，重新驗證相互作用消除假陽性。按表1組合，轉化后的酵母菌涂布于SD–Trp/-Leu/-His/-Ade/Aba/X-α-gal平板上，30 ℃培養(yǎng)5～7 天，篩選藍色克隆而且無自激活性的蛋白即為相互作用的蛋白。

表1 　陽性克隆再驗證的質粒組合方案

8.對相互作用蛋白X進行測序和序列分析

以pGADT7載體引物對AD–X進行測序，測序結果與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST分析和序列結構分析。

心得經(jīng)驗：

酵母雙雜交系統(tǒng)對于研究蛋白與蛋白之間的相互作用雖然具有篩選量大、效率高及應用廣泛等優(yōu)點，但有它自身的缺陷。酵母培養(yǎng)的周期與大腸桿菌相比較長，酵母轉化的過程較繁復，耗時較長，而且存在假陽性較多的問題，陽性克隆工作量太大，驗證工作繁重。在此項目中酵母雙雜交實驗zui關鍵的步驟是酵母培養(yǎng)時間的掌控。在吸取5uL轉入含50mL YPDA液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，30℃120rpm/min振蕩培養(yǎng)的步驟中其OD600達到0.15-0.3(16-20h)很重要，這關系到酵母細胞的濃度及生長狀態(tài)。且下一步把沉淀下來的酵母細胞轉入含100mLYPDA液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，30℃120rpm/min振蕩培養(yǎng)達到其OD600達到0.4-0.5(3-5h)同樣重要。在這3-5h培養(yǎng)的原因是讓細胞至少完成兩次分裂，而且在細胞3-4次分裂間，轉化效率恒定。在酵母交配實驗中，30 ℃、80r/min恒溫振蕩培養(yǎng)時間20-24h也甚為重要，培養(yǎng)時間應由在顯微鏡下是否能看到米奇頭形狀的雜交細胞為準，如果沒有觀察到雜交細胞，應適當延長培養(yǎng)時間，而如果觀察到，應停止振蕩培養(yǎng)，防止雜交細胞增殖，增加篩選工作量。培養(yǎng)酵母菌Y2HGold/pGBKT7- CaM(SD/-Trp)時，出現(xiàn)了酵母菌種從第四天開始出現(xiàn)變紅的情況，查找資料得知是由于酵母菌在缺乏腺嘌呤的生長環(huán)境中，產(chǎn)生紅色代謝物的導致的。因而應盡量縮短此步的培養(yǎng)時間。本項目用變紅的菌進行下一步的步驟，實驗結果并沒有受影響，且變紅的菌在腺嘌呤豐富的YPDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，后代菌種恢復白色。綜上，酵母培養(yǎng)時間的控制是酵母雙雜交實驗成功的關鍵。

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