細(xì)胞培養(yǎng)：
RL95-2 細(xì)胞在 DMEM/F12(1:1)的培養(yǎng)液(含 10%胎牛血清，10mmol/lHEPERS，5g/ml 胰島素，100IU/ml青霉素，和100g/ml鏈霉素)中培養(yǎng)，pH7.4。 37℃, 5% CO2,飽和濕度條件下培養(yǎng)。每 2-3 天換液一次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況。在細(xì)胞生長對(duì)數(shù)期，消化離心后重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)為 1×106 個(gè)/ml,接種于六孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞長滿后，加入無血清的培養(yǎng)基饑餓24小時(shí)。在不同孔中分別加入孕激素，其終濃度分別為10-5mol/l, 10-6mol/l,10-7mol/l， 10-8mol/l；加入無血清的培養(yǎng)基作空白對(duì)照；加入孕激素和米非司酮，終濃度均為 10-5mol/l。在 37℃, 5% CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，收集細(xì)胞檢測。

RT-PCR：
采用RNA快速抽提純化試劑盒(Qiagen)提取組織RNA, 操作按試劑盒說明書要求進(jìn)行。cDNA體外合成條件為50℃45min,99℃5min。 PCR反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性5min;95℃變性30s, 57℃退火30s, 72℃延伸50s, 35個(gè)循環(huán); zui后72℃延伸5 min。

Western blot：
細(xì)胞加入蛋白質(zhì)裂解液中(每1000mlPBS中加入l0 mlNP-40和10mlPMSF (上海滬鼎生物科技有限公司)。充分混勻后置于4℃靜置2h, 4℃,11000×g離心15min, 將上清置于新的EP管中?？捡R斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白估量后, 進(jìn)行Western blotting 分析。所用一抗為羊抗人FUT7(Santa Cruz Biotech),1∶200 使用或sLeX(Santa Cruz Biotech) 1∶300使用; 二抗（生物素化抗羊IgG1:800，或生物素化抗鼠 IgM1:500，1%TTBS 稀釋） 37℃孵育45分鐘；三抗（AP標(biāo)記鏈霉卵白素1:800，1%TTBS稀釋）37℃孵育45分鐘；加入AP反應(yīng)底物NBT/BCIP，避光處顯色5-20分鐘，蒸餾水清洗終止反應(yīng)。

免疫熒光染色：
細(xì)胞置24孔培養(yǎng)板內(nèi)蓋玻片上培養(yǎng)。經(jīng)不同處理后，取出蓋玻片, PBS沖洗后于4%-3-多聚甲醛/PBS4℃固定30min，于0.2%TritonX-100/PBS室溫下處理10min，再經(jīng)3%BSA(Sigma)/PBS37℃封閉2h后, 取出玻片, 置1∶300FuT7羊抗鼠多克隆抗體(SantaCruz Biotech)或1∶200sLeX抗體中, 37℃孵育2h(或 4℃過夜), 經(jīng)清洗后, 加入1∶100 FITC標(biāo)記的上海滬鼎生物科技有限公司兔抗羊IgG或TRITC標(biāo)記的抗鼠sLeX二抗, 37℃孵育1h; zui后以甘油封片, 于熒光顯微鏡下觀察并照相記錄結(jié)果。