一、實(shí)驗(yàn)試劑

1、碳酸氫鹽/碳酸鹽包被緩沖液 (100 mM)

2、PBS

3、封閉液

4、洗滌液

5、抗體稀釋緩沖液

二、實(shí)驗(yàn)步驟

1. 包被抗原

1) 用 PBS 或碳酸鹽緩沖液稀釋抗原至終濃度 20 μg/ml。吸取 50 μl 稀釋抗原到 PVC 酶標(biāo)板上的*排孔，按要求往后進(jìn)行系列稀釋。

2) 酶標(biāo)板上覆蓋封口膜，室溫孵育 2 小時(shí)，或者 4 °C 過夜。孵育時(shí)間需要優(yōu)化。

3) 倒掉包被液，用 PBS 洗板 3 次，每孔 200 μl。在水池上輕甩倒掉洗液，在紙巾上輕拍酶標(biāo)板除去殘留液體。

2. 封閉

1) 用含 5% 脫脂奶粉或含 5% 血清的 PBS 緩沖液封閉酶標(biāo)板上剩余的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，每孔加 200 μl。也可用其他封閉劑如 block ACE、BSA（牛血清蛋白）代替。

2) 封口膜覆蓋酶標(biāo)板室溫至少孵育 2 小時(shí)，或者 4 °C 過夜。

3) PBS 洗板 2 次。

3. 加一抗和二抗進(jìn)行孵育

1) 每孔加入 100 μl 稀釋好的一抗。

2) 封口膜覆蓋酶標(biāo)板室溫孵育 2 小時(shí)，孵育時(shí)間需要進(jìn)行優(yōu)化。通常 2 小時(shí)孵育即可獲得足夠強(qiáng)的信號，但如果獲得的信號較弱時(shí)，可4 °C 孵育過夜獲得較強(qiáng)信號。

3) PBS 洗板 4 次。

4) 加標(biāo)記二抗，每孔 100 μl。稀釋到濃度（參照說明書），使用前用封閉液現(xiàn)配。

5) 封口膜覆蓋酶標(biāo)板室溫孵育 1-2 小時(shí)。

6) PBS 洗板 4 次。

4. 檢測

1) 用多通道吸液器向每孔加入 100 μl（或 50 μl）底物。

2) 顯示出足夠深的顏色后，加終止液每孔 100 μl（如有必要）。

3) 酶標(biāo)儀讀取吸光度值（光密度）。