［摘 要］ 目的：了解無錫地區(qū)HBV前C／C基因變異情況,探討基因變異對乙肝病毒標(biāo)志物（HBVM）及HBV DNA定量的影響。方法： HBVM用時(shí)間分辨熒光定量試劑檢測;HBV DNA定量PCR以德國Roche Lightcycler 熒光定量擴(kuò)增儀檢測;HBV DNA前C／C測序使用①德國Roche Mag NA Pure LC 全自動核酸提取，加樣系統(tǒng);②美國Beckman Coulter CEQ 8000 Genetic Analysis System。結(jié)果： 92例乙肝患者血清中有41例（446％）發(fā)生前C／C區(qū)nt1896位變異,41例中有34例HbeAg陰性,7例HbeAg仍為陽性;以nt1896位是否變異分組,變異組和未變異組HBV DNA定量無顯著性差異。結(jié)論： nt1896位變異導(dǎo)致HBeAg轉(zhuǎn)陰,HBV病毒變異對HBVM有決定性的影響,但該變異對HBV復(fù)制無影響。
    HBV感染在臨床可產(chǎn)生不同的肝臟疾病譜,過去多以HBV免疫學(xué)標(biāo)志物來判斷病毒感染狀況［1］。但隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,研究發(fā)現(xiàn)肝臟疾病譜不僅與宿主的免疫有關(guān),也與病毒本身密切相關(guān),即HBV 本身也存在變異。對HBV變異的判斷,zui可靠和的方法是從病人體內(nèi)檢出HBV DNA,用DNA測序法來確定病毒的變異,目前對于HBV的變異的研究比較集中在關(guān)于前C區(qū)及S基因區(qū)的變異。本文結(jié)合92例乙肝患者的PCR定量、免疫學(xué)標(biāo)志物定量結(jié)果以及DNA前C／C區(qū)測序結(jié)果報(bào)道如下。
    1  材料與方法
    11  分析對象
    本組92例為無錫地區(qū)2004年1月~10月在無錫市傳染病醫(yī)院門診及住院的乙肝患者,均為HBVDNA陽性病人。
    12  檢測方法
    121  乙肝病毒標(biāo)志HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗Hbe和抗HBc以美國PE123utomatic immunoassay system 檢測,試劑為上海新波產(chǎn)的兩對半時(shí)間分辨熒光定量試劑。
    122  定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)（PCR）HBV DNA定量PCR  以德國Roche Lightcycler熒光定量擴(kuò)增儀檢測,試劑為深圳匹基產(chǎn)HBV DNA熒光定量試劑。
    123  HBV DNA前C／C區(qū)測序 使用①德國Roche MagNA Pure LC全自動核酸提取、加樣系統(tǒng),獲得HBV DNA模板;②在美國PE9600擴(kuò)增儀擴(kuò)增:94℃預(yù)變性3 min,94℃ 30 s,50℃ 30 s,72℃ 30 s,循環(huán)35次;③用Promega公司的PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物;④純化產(chǎn)物用Beckman測序試劑盒進(jìn)行測序反應(yīng):96℃ 20 s,55℃ 20 s,60℃4 min,循環(huán)30次,終止測序反應(yīng),然后在美國Beckman Coulter CEQ8000 Genetic Analysis System上得到HBV DNA 的序列和圖譜。所測HBV DNA序列的堿基位置:nt17372483,所測長度:746 bp,上游引物序列及位置:5’GAGTTGGGGGAGATTAG3’（17371756）,下游引物序列及位置:5’AAAGTTTCCCACCTTATGAGTC3’（24832462）;引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。
    124  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)。
    2  結(jié) 果
    略
    3  討 論
    表1中HBV DNA 1827位ntc→a突變達(dá)88％, 表2  HBVM與1896位變異表3  1896位變異與e抗原相關(guān)性表4  病毒與DNA定量相關(guān)性基本體現(xiàn)無錫地區(qū)HBV DNA單核苷酸多態(tài)性突變水平,意義目前不詳。1896位ntg→a突變達(dá)446％（41／92）,據(jù)國外報(bào)道,這種變異大多發(fā)生在亞洲東部及南歐地區(qū),發(fā)生率可以高達(dá)47％～60％,而在美國只有10％左右,胡耀仁等［2］報(bào)道寧波乙肝患者1896位變異率為4258％,本文結(jié)果與報(bào)道相近。由于1896位ntc→a突變（*→腺嘌呤）,使原來編碼*的前C區(qū)第28個(gè)密碼子（TGG）轉(zhuǎn)變?yōu)榉g終止密碼子（TAG）,因而前C蛋白的翻譯中斷,HBeAg不能產(chǎn)生,檢測會出現(xiàn)陰性結(jié)果,從表3中可見,與變異有關(guān)HBeAg轉(zhuǎn)陰有34例,從而證實(shí)1896位變異與HBeAg轉(zhuǎn)陰具有密切相關(guān)性。2005位ntt→a突變和2074位ntt→c突變因?yàn)槭敲艽a子的第三堿基發(fā)生突變,翻譯的氨基酸仍是原來的氨基酸,屬同義突變。
    圖譜分析是測序儀利用4種熒光染料分別標(biāo)記終止物ddNTP,通過電泳將各個(gè)熒光標(biāo)記片段分開,經(jīng)激光掃描,光柵分光,區(qū)分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光,在 CCD攝影機(jī)上同步成像。圖1顯示1896位正常為G,圖2顯示1896位發(fā)生突變?yōu)锳。
    從表3可以看出（由表2中統(tǒng)計(jì)而來）,1896位變異組共有41例,其中34例e抗原陰性,說明與1896位變異有密切關(guān)系（P<0005）;有7例e抗原仍為陽性,可能與體內(nèi)仍存在野生株復(fù)制的情況有關(guān)。在51例1896位未變異一組,其中13例e抗原陰性,而HBV DNA定量顯示有病毒的復(fù)制,與理論結(jié)果不符,原因可能與其他位點(diǎn)變異有關(guān)。
    從表4中可以看出以nt1896位變異分組,兩組病毒DNA定量無顯著性差異（P>005）,說明1896位變異會導(dǎo)致HBeAg不能產(chǎn)生,檢查陰性結(jié)果,但不能反映HBV復(fù)制減輕和消失,而仍有HBV前C區(qū)變異病毒的存在和復(fù)制,結(jié)論與文獻(xiàn)相符［3］。
    李伯安等［4］認(rèn)為單獨(dú)的血清學(xué)標(biāo)志檢測不能反映肝臟的病變程度,也不能良好反映病毒的復(fù)制。
    臨床上對不同肝臟疾病譜的認(rèn)識,有必要結(jié)合二對半結(jié)果和PCR DNA定量以及基因測序結(jié)果,才會對乙肝病毒的感染狀況有一個(gè)比較準(zhǔn)確的判斷,才能對癥治療,取得較好的治療效果。由于前C／C區(qū)1896位的變異,導(dǎo)致HBeAg轉(zhuǎn)陰,不能就此而否定病毒的復(fù)制。
    測序結(jié)果表明,HBV病毒基因變異對HBVM結(jié)果產(chǎn)生根本性的影響,它們是基因型和表現(xiàn)型的關(guān)系,即基因型決定表現(xiàn)型,但病毒復(fù)制繼續(xù)進(jìn)行。