實驗常見問題分析與解決方案

來源：上海金鵬分析儀器有限公司 2024年05月21日 08:32

上海金鵬分析儀器有限公司針對WB做不好的常見問題分析與解決方案：

問題	可能原因	驗證或解決辦法
背景較高	封閉不充分	延長封閉時間，更換合適的封閉劑(脫脂奶粉，BSA,血清等)
	一抗?jié)舛冗^高	增加一抗稀釋倍數(shù)，
	抗體孵育溫度過偏高	建議4℃孵育
	二抗非特異性結(jié)合或與封閉劑交叉反應	設置二抗對照(不加一抗),降低二抗?jié)舛?/td>
	一抗或二抗與封閉劑有交叉反應	在孵育和洗滌液中加入Tween-20以減少交叉反應.
	洗膜不充分	增加洗滌次數(shù)
	膜不合適	NC膜比PVDF膜背景低
	膜干燥	保證充分的反應液，避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象
沒有陽性條帶或很弱	一抗、二抗等不匹配	訂購試劑時認真選取一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間相匹配的抗體及底物?？赏ㄟ^設置內(nèi)參可以驗證二級檢測系統(tǒng)的有效性。
	-抗或/和二抗?jié)舛鹊?/td>	增加抗體濃度，延長孵育時間
	封閉劑與一抗或二抗有交叉反應	封閉時使用溫和的去污劑，如TWEEN20,或更換封閉劑(常用的脫脂奶、BSA、血清或明膠
	一抗不識別目的物種的靶蛋白	檢查說明書，或做ClustalW比對，設陽性對照
	樣本中無靶蛋白或靶蛋白含量過低(抗原無效)	設置陽性對照，如果陽性對照有結(jié)果，但標本沒有則可能是標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。后者可增加標本上樣量至少每孔 20-30ug蛋白，樣本制備時使用蛋白酶抑制劑，或分級提取目的蛋白。
	轉(zhuǎn)膜不充分，或洗膜過度	使用麗春紅S檢測轉(zhuǎn)膜效果，PVDF膜需浸透，需正確的轉(zhuǎn)膜操作，勿過度洗膜
	過度封閉	使用含0.5%脫脂奶或無脫脂奶的抗體稀釋液，或更換封閉劑，減少封閉時間
	一抗失效	使用有效期內(nèi)抗體，分裝保存，避免反復凍融取用，工作液現(xiàn)配現(xiàn)用
	二抗受疊氮鈉抑制	所用溶液和容器中避免含有疊氮鈉(HRP的抑制劑)
	酶和底物失效	直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了、選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物，使用新鮮的底物.
	曝光時間過短	延長曝光時間
多非特異性條帶或條帶位置不對	細胞傳代次數(shù)過多，使其蛋白表達模式的分化	使用原始或傳代少的細胞株，或平行實驗
	體內(nèi)表達的蛋白樣本具有多種修飾形式：乙?；?、磷酸化、甲基化、烷基化、糖基化等	查文獻，使用去修飾的試劑使蛋白恢復其正確的大小
	蛋白樣本降解	使用新鮮制備的標本，并使用蛋白酶抑制劑
	新蛋白或同族蛋白的分享同種表位的不同剪接方式	查其它文獻報導，或BLAST搜尋，使用說明書報導的細胞株或組織
	一抗?jié)舛冗^高	降低抗體濃度，可以減少非特異性條帶
	二抗?jié)舛冗^高產(chǎn)生非特異性結(jié)合	降低抗體濃度，增加二抗對照選擇特異性更強，只針對重鏈的二抗
	抗體未純化	使用單克隆或親和純化的抗體，減少非特異條帶
	蛋白存在二聚體或多聚體	SDS-PAGE電泳上樣前，煮沸10 min,

		以增強蛋白質(zhì)解聚變性
背景有白色/黑色斑點	轉(zhuǎn)膜時有氣泡或抗體分布不均	盡量去除氣泡，抗體孵育時保持搖動
背景有白色/黑色斑點	抗體與封閉劑結(jié)合	過濾封閉劑
暗片現(xiàn)白條帶	一抗或二抗加入過多	稀釋抗體的濃度
目的條帶過低/ 過高	SDS-PAGE膠濃度選擇不合適	調(diào)整膠濃度，分子量大的蛋白用低濃度膠，分子量小的蛋白用高濃度膠
“微笑”條帶	遷移過快，電泳溫度過高	降低電泳速度，低溫電泳(冷室)
轉(zhuǎn)膜不充分	膜沒有均勻濕透	使用99%methanol漫透膜
	靶蛋白分子量小于10,000	選擇小孔徑的膜，縮短轉(zhuǎn)移時間
	靶蛋白等電點等于或接近轉(zhuǎn)移緩沖液pH值	\|可嘗試使用其他緩沖液如CAPS緩沖液(pH10.5)或使用低pH值緩沖液如乙酸緩沖液
	甲醇濃度過高	過高甲醇濃度會導致蛋白質(zhì)與SDS分離，從而沉淀在凝膠中，同時會使凝膠收縮或變硬，從而抑制高分子量蛋白的轉(zhuǎn)移。降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代替
	轉(zhuǎn)移時間不夠Thick gel	對于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長轉(zhuǎn)移時間

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