PCR反應(yīng)設(shè)計引物需考慮問題：

1．酶切位點

兩個酶切位點應(yīng)是載體上的，所連接片斷上沒有這兩個位點，且距離不能太近，否則往往導致兩個酶都切不好。因此，兩個酶切位點要緊挨在一起，只能切一個，除非恰好是與上面兩個酶在一起的酶切位點，最好隔四個核苷酸。且不能有堿基的交叉，比如AGATCTTAAG，這樣的位點比較難切。

2．酶的選擇

最好使用雙酶切效率高的，但兩個酶切點最好不要是同尾酶（切下來的殘基不要互補），否則效果相當于單酶切，最好使用具有共同buffer，且較常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），這樣可以省錢。

3．Tm的計算。

Tm是由互補的DNA區(qū)域決定的，而不互補的區(qū)域?qū)NA的溶解是沒有作用的。因此，對于引物的Tm，只有和模板互補的區(qū)域?qū)m才有貢獻。計算Tm時，只計算互補的區(qū)域（除非你的酶切位點也與模板互補）。設(shè)計引物的時候，先不管5'端的修飾序列，把互補區(qū)的Tm控制在55度以上（我喜歡控制在58以上，具體根據(jù)PCR的具體情況，對于困難的PCR，需要適當提高Tm），再加上酶切位點和保護堿基，這樣的引物通常都是可用的，即使有小的問題，也可以挽回。

Tm溫度高的引物就比較容易克服3’發(fā)卡、二聚體及3'非特異結(jié)合等問題。簡單的計算公式可以用2+4的公式。若你計算的Tm值達到了快90 ，不包括酶切位點。引物公司給你發(fā)的單子是包括酶切位點的。自己可以再估計一下。如你設(shè)計了帶酶切位點的引物，總長分別為29、33個堿基，去掉酶切位點和保護堿基，分別為17、21個堿基。引物公司給的單子是70多度，實際用的只有50度，用55度擴的結(jié)果也差不多。

其它關(guān)于Tm值的計算，有用PP5.0進行評價的，需要考慮base number、GC%、Tm、hairpin、dimer、false priming、cross dimer等參數(shù)。

4．退火溫度

退一般退火溫度為Tm-5度，退火溫度的計算可以不把加入的酶切位點及保護堿基考慮進去， PCR幾個循環(huán)后，引物外側(cè)的序列已經(jīng)參入了擴增片斷中，所以你可以在預變性后多加幾步，溫度比你Tm值低些（這樣可能會增加非特異性），Tm值是你包括酶切位點及保護堿基的Primer計算出來的。

5．5’端保護堿基

一般在5'端加保護堿基,如果你擴增后把目的條帶做膠回收轉(zhuǎn)入T-VECTOR或者其它的載體的話,酶切時可以不需加保護堿基

6．引物二聚體

關(guān)于引物二聚體，最好用primer或是其他設(shè)計引物的軟件進行計算一下，看看引物之間的△G（自由能）的絕對值，如果小于10，一般是問題的。如果稍大，PCR時可以提高一下退火溫度，一般是沒有問題的。如果3’端形成二聚體，并且自由能絕對值較大，如果 PCR沒有條帶，建議重新設(shè)計引物。此外，所加的三個核苷酸的保護序列經(jīng)過盡心設(shè)計有時也可以降低二聚體的△G。

7．引物的設(shè)計

在設(shè)計酶切位點時，最好能盡可能多的利用引物本身的堿基。這是因為，一個特異性引物一般都是20bp左右，再加上酶切位點序列和保護性堿基，大致就是28bp左右了。而我們在設(shè)計退火溫度時，與引物的長度有關(guān)，比正常的引物(20bp) 的Tm肯定要高一些。如果我們能利用引物自身的部分序列，就可以有效地減少引物的長度。

還有，有些酶是離不開末端序列的，因此，在設(shè)計一個酶位點時，最好把該酶的性質(zhì)弄清楚。設(shè)計時限制性酶切位點是應(yīng)該在5’端的頂端。在設(shè)計引物時，常在5’端添加酶切位點，以利于PCR產(chǎn)物連接到載體。

設(shè)計引物時保證在最后5個核苷中含有3個A或T。先用軟件設(shè)計出合適的引物，引物的3’端是引發(fā)延伸的起點，因此一定要與模板準確配對，應(yīng)盡量避免在引物3’端的第1位堿基是A（容易錯配）。引物3’端最佳堿基的選擇是G和C，因為他們形成的堿基配對比較穩(wěn)定。目的序列上并不存在的。