研究背景

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）作為全球重要的優(yōu)質(zhì)牧草之一，其雜交育種對(duì)提升產(chǎn)量和品質(zhì)至關(guān)重要。然而，作為異花授粉的異源四倍體作物，苜蓿的基因組復(fù)雜性使其雄性不育的分子機(jī)制長(zhǎng)期成謎?；ㄋ幇l(fā)育作為植物生殖的核心過(guò)程，涉及絨氈層分化、花粉壁形成等精密環(huán)節(jié)，而MYB家族轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥等模式植物中已被證實(shí)為關(guān)鍵調(diào)控因子，但在苜蓿中仍未得到充分研究。

文獻(xiàn)解讀

2025年3月17日，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)徐博教授團(tuán)隊(duì)在Plant Journal發(fā)表了題為“Anther-specific expression of MsMYB35 transcription factor in alfalfa (Medicago sativa L.) and its crucial role in pollen development”的研究論文。該研究聚焦紫花苜蓿中MsMYB35基因，借助DAP-seq技術(shù)在全基因組范圍內(nèi)鎖定其結(jié)合位點(diǎn)，揭示了該基因通過(guò)茉莉酸信號(hào)通路和細(xì)胞壁重塑通路調(diào)控花藥發(fā)育的分子機(jī)制，為解析苜?；ㄋ幇l(fā)育的調(diào)控機(jī)制及分子育種提供理論依據(jù)。

技術(shù)路線

研究結(jié)果

研究發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿MsMYB35基因在花藥中表達(dá)量顯著高于根、莖、葉，且在雄性不育系MSJN1A的小孢子母細(xì)胞和四分體時(shí)期表達(dá)量低于保持系MSJN1B。原位雜交顯示，該基因轉(zhuǎn)錄本從小孢子母細(xì)胞期至成熟花粉期存在于小孢子與絨氈層細(xì)胞，推測(cè)在花藥發(fā)育早期（尤其四分體時(shí)期）起重要作用。MsMYB35屬于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子家族，其N端含經(jīng)典R2R3結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，MsMYB35與蒺藜苜蓿（MtMYB35）、大豆（GmMYB35）等物種的同源蛋白進(jìn)化關(guān)系密切，功能保守，可能參與花藥發(fā)育和花粉形成。亞細(xì)胞定位顯示其定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核（以核膜為主），表明其可能通過(guò)調(diào)控核內(nèi)轉(zhuǎn)錄及胞質(zhì)過(guò)程參與花藥發(fā)育調(diào)控。

圖1. MsMYB35基因表達(dá)分析。

圖2. 紫花苜蓿MsMYB35的氨基酸序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育分析。

圖3. MsMYB35亞細(xì)胞定位分析。

為研究MsMYB35轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，作者通過(guò)DAP-seq鑒定出MsMYB35在基因組中的14,992個(gè)結(jié)合峰，其中8,097個(gè)高可靠性位點(diǎn)主要分布于基因間區(qū)（62.7%）和啟動(dòng)子區(qū)（16.6%），富集到AAAAA、TAAC、GA(A/G)三類保守基序，對(duì)應(yīng)3,647個(gè)靶基因。GO富集分析顯示，這些基因富集于“植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”、“花發(fā)育調(diào)控”等生物過(guò)程。結(jié)合RNA-seq數(shù)據(jù)，篩選出467個(gè)直接調(diào)控基因（261個(gè)正調(diào)控、207個(gè)負(fù)調(diào)控）。KEGG富集分析顯示，其顯著富集于苯丙烷代謝、茉莉酸（JA）合成、細(xì)胞壁重塑（如果膠裂解酶通路）等與花藥發(fā)育密切相關(guān)的代謝途徑。進(jìn)一步通過(guò)酵母單雜交（Y1H）和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)MsMYB35可直接結(jié)合MsJMT和MsPL的啟動(dòng)子并激活其轉(zhuǎn)錄，表明其通過(guò)調(diào)控JA甲基轉(zhuǎn)移酶和果膠酸裂解酶影響花藥發(fā)育。外源MeJA處理實(shí)驗(yàn)表明，不育系花藥發(fā)育缺陷可通過(guò)MeJA處理部分恢復(fù)，證實(shí)MsMYB35-JA通路在絨氈層發(fā)育和花粉成熟中的核心作用。

圖4. 通過(guò)DAP-seq技術(shù)對(duì)MsMYB35結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行的全基因組鑒定。

圖5. RNA-seq與DAP-seq數(shù)據(jù)聯(lián)合分析。

圖6. MsMYB35靶向花藥發(fā)育相關(guān)基因啟動(dòng)子。

圖7. 不同發(fā)育階段花蕾中茉莉酸(JA)含量變化及對(duì)應(yīng)花藥形態(tài)特征。

為進(jìn)一步探究MsMYB35的功能，作者構(gòu)建了MsMYB35-OE和RNAi轉(zhuǎn)基因植株。RT-PCR顯示，MsMYB35-OE株系基因表達(dá)顯著上調(diào)，RNAi株系則顯著下調(diào)。表型分析表明，過(guò)表達(dá)株系與野生型無(wú)明顯差異，而RNAi株系出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制、分枝減少、開花延遲等現(xiàn)象。組織學(xué)分析表明，RNAi植株在四分體階段即出現(xiàn)絨氈層結(jié)構(gòu)不連續(xù)，單核期花粉液泡化，雙核期表皮破裂，成熟花粉無(wú)法形成。研究表明MsMYB35表達(dá)水平直接影響絨氈層發(fā)育、花粉壁形成及花藥開裂過(guò)程，其適當(dāng)表達(dá)是花粉正常發(fā)育的必要條件，為解析苜蓿雄性不育機(jī)制及分子育種提供了關(guān)鍵依據(jù)。

圖8. 轉(zhuǎn)基因苜蓿與野生型植株中MsMYB35基因的表達(dá)水平。

圖9. 野生型和過(guò)表達(dá)MsMYB35紫花苜蓿不同發(fā)育階段的細(xì)胞學(xué)觀察。

圖10. 苜?；ㄋ幇l(fā)育中MsMYB35的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型。