現(xiàn)在隨著科技的進(jìn)步，菌落計(jì)數(shù)技術(shù)日趨*。主要體現(xiàn)在配置越來越高，功能越來越全。計(jì)數(shù)的速度越來越快，準(zhǔn)確性也越來越高。
為了正確地檢測各種需氧和兼性厭氧菌存在的情況，檢驗(yàn)時(shí)必須遵循以下一些要求和規(guī)定：
(一)所用器皿及稀釋液：
1.檢驗(yàn)中所用玻璃器皿，如培養(yǎng)皿，吸管、試管等必須是滅菌的，并在滅菌前洗滌干凈，不得殘留有抑菌物質(zhì)。
2.用作樣品稀釋的液體，每批都要有空白對照。如果在瓊脂對照平板上出現(xiàn)幾個(gè)菌落時(shí)，要追加對照平板，以判定是空白稀釋液，用于傾注平皿的培養(yǎng)基，還是平皿吸管或空氣可能存在的污染。
3.檢樣的稀釋液雖可用生理鹽水或磷酸鹽緩沖液，但以用磷酸緩沖鹽水為合適，因?yàn)榱姿猁}緩沖液對細(xì)菌細(xì)胞有更好的保護(hù)作用，不會因?yàn)樵谙♂屵^程中而使食品檢樣中原已受損傷的細(xì)菌細(xì)胞導(dǎo)致死亡。如果對含鹽量較高的食品(如，醬品等)進(jìn)行稀釋，則宜采用蒸餾水。
(二)檢樣稀釋：
1.檢樣稀釋時(shí)，應(yīng)以無菌操作稱取(或量取)有代表性的樣品25g(或mL)剪碎放于含有225ml滅菌稀釋液的玻璃瓶內(nèi)(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)，經(jīng)充分振搖作成l：10的稀釋液。如，系肉、魚等固體樣品，剪細(xì)于滅菌乳缽內(nèi)與稀釋液研勻，或與稀釋液同置于滅菌均質(zhì)器杯或拍擊式均質(zhì)袋中，使做成均勻的1：10稀釋液。
2.根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)?biāo)本污染情況的估計(jì)，將上述1:10的檢樣稀釋液再做成幾個(gè)適當(dāng)?shù)?0倍遞增稀釋液。即取1：10稀釋液1mL與9mL稀釋液混和做成l：100的稀釋液，然后依次遞增稀釋，做成1：1000、1：10000等稀釋液。注意每遞增稀釋一次，必須另換1支l mL滅菌吸管，這樣所得檢樣的稀釋倍數(shù)方為準(zhǔn)確。
3.從吸管筒內(nèi)取出滅菌吸管時(shí)，不要將吸管碰著其他仍留在容器內(nèi)的吸管的外露部分；而且吸管在進(jìn)出裝有稀釋液的玻璃瓶和試管時(shí)，也不要觸及瓶口及試管口的外側(cè)部分；因?yàn)檫@些部分都可能接觸過手或其他沾污物。
4.在作10倍遞增稀釋中，吸管插入檢樣稀釋液內(nèi)不能低于液面2.5cm；吸入液體時(shí)，應(yīng)先高于吸管刻度，然后提起吸管離開液面，將貼于玻璃瓶或試管的內(nèi)壁時(shí)吸。管內(nèi)液體調(diào)至所要求的刻度，這樣取樣較準(zhǔn)確，而且在吸管從稀釋液內(nèi)取出時(shí)不會有多余的液體粘附于管外。
5.當(dāng)用吸管將檢樣稀釋液加至另一裝有9mL空白稀釋液的試管內(nèi)時(shí)，應(yīng)小心沿管壁加入，不要觸及管內(nèi)稀釋液，以防吸管外側(cè)部分粘附的檢液也混入其中。
(三)平板接種與培養(yǎng)：
1.將稀釋液加至滅菌平皿內(nèi)時(shí)，應(yīng)根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)?biāo)本污染情況的估計(jì)，選擇2～3個(gè)適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時(shí)，即以吸取該稀釋度的吸管移lmL稀釋液加入皿內(nèi)(從皿側(cè)加入，不要揭去皿蓋)，最后將吸管直立使液體流畢，并在皿底干燥處再擦一下吸管尖將余液排出，而不要吹出。每個(gè)稀釋度應(yīng)作2個(gè)平皿。
2.用于傾注平皿的營養(yǎng)瓊脂應(yīng)預(yù)先加熱使融化，并保溫于45±1℃恒溫水浴中待用。傾注平皿時(shí)，每皿內(nèi)傾入約15~20mL，最后將瓊脂底部帶有沉淀的部分棄去。
3.為了防止細(xì)菌增殖及產(chǎn)生片狀菌落，在檢液加入平皿后，應(yīng)在20分鐘內(nèi)向皿內(nèi)傾入瓊脂，并立即使其與瓊脂混和均勻。
4.檢樣與瓊脂混和時(shí)，可將皿底在平面上先向一個(gè)方向旋轉(zhuǎn)，然后再向相反的方向旋轉(zhuǎn)，以使充分混勻。旋轉(zhuǎn)中應(yīng)加小心，不要使混和物濺到皿邊的上方。為了保證混和均勻，而不濺及皿邊的上方，可使用自動平皿旋轉(zhuǎn)儀，直接將加有檢樣的平皿放在旋轉(zhuǎn)儀上(可同時(shí)放4只平皿)，加入瓊脂后，開動電鈕，在數(shù)十秒鐘內(nèi)即可自動左右旋轉(zhuǎn)而使皿內(nèi)的檢樣與瓊脂混合均勻。
5.皿內(nèi)瓊脂凝固后，不要長久放置，然后始翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)，而應(yīng)于瓊脂凝固后，在數(shù)分鐘內(nèi)即應(yīng)將平皿翻轉(zhuǎn)予以培養(yǎng)，這樣可避免菌落蔓延生長。必要時(shí)，可先將皿打開倒置(皿底向上)于溫箱內(nèi)經(jīng)15~60分鐘使瓊脂表面干燥后，再將皿底移至蓋內(nèi)倒置于溫箱內(nèi)培養(yǎng)。這樣可以阻止運(yùn)動性強(qiáng)的變形桿菌屬、假單胞菌屬和芽胞桿菌屬中一些菌株在瓊脂表面擴(kuò)展生長。
6.為了控制污染，在取樣進(jìn)行檢驗(yàn)的同時(shí)，于工作臺上打開一塊瓊脂平板，其暴露的時(shí)間，應(yīng)與該檢樣從制備、稀釋到加入平皿時(shí)所暴露的最長的時(shí)間相當(dāng)，然后與加有檢樣的平皿一并置于溫箱內(nèi)培養(yǎng)，以了解檢樣在檢驗(yàn)操作過程中有l(wèi)無受到來自空氣的污染。
7.培養(yǎng)溫度：
應(yīng)根據(jù)食品種類而定。肉、乳、蛋類食品用37℃培養(yǎng)，水產(chǎn)品用30℃培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間為48±2小時(shí)。培養(yǎng)溫度和時(shí)間之所以有這種不同的區(qū)分，乃是因?yàn)樵谥贫ㄟ@些食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于菌落總數(shù)的規(guī)定時(shí)，分別采用了不同的溫度和培養(yǎng)時(shí)間所取得的數(shù)據(jù)之故。水產(chǎn)品因來自淡水或海水，水底溫度較低，因而制定水產(chǎn)品細(xì)菌方面的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，系用30℃作為培養(yǎng)的溫度。
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