聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase chain reaction,PCR)是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或 DNA 序列的方法。

一般操作步驟：

1.反應(yīng)體系與反應(yīng)條件的選擇

現(xiàn)在市面上的商品化的 DNA 聚合酶有多種，里面也配備了相應(yīng)的 Buffer，包含各種所需的催化離子與緩沖液的成分，實(shí)驗(yàn)時(shí)只需要按照說(shuō)明書加以稀釋并配制反應(yīng)體系即可，有時(shí)也可以同等比例放大或縮小，需要說(shuō)明的是同等比例的放大或縮小并不意味著實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物同等比例的縮放。

2.酶的選擇

早期的 PCR 擴(kuò)增是由大腸桿菌 DNA 聚合酶Ⅰ的 Klenow 片段完成的，但是這種酶不耐熱，每一個(gè)循環(huán)之后都需要加入新的酶。從嗜熱水生菌(Thermus aquaticus)中提取的 Taq DNA 聚合酶在較高溫度下依然保留活性，避免了繁瑣的操作，簡(jiǎn)便了 PCR 的步驟。現(xiàn)今，各個(gè)公司對(duì)酶的稱呼不一，很多經(jīng)過(guò) Taq 酶改造而來(lái)，也有其它來(lái)源的 DNA 聚合酶，建議綜合考慮保真性、擴(kuò)增速度、操作簡(jiǎn)便性、價(jià)格等衡量因素選擇合適的 DNA 聚合酶。此外，過(guò)高的溫度以及過(guò)長(zhǎng)的時(shí)間對(duì) DNA 聚合酶的活性都有影響。

3.循環(huán)參數(shù)的設(shè)定

依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?，一般的檢測(cè)質(zhì)粒構(gòu)建是否成功，20-24 個(gè)循環(huán)就可以；而對(duì)于構(gòu)建過(guò)程獲得 PCR 產(chǎn)物來(lái)說(shuō)一般 28-34 個(gè)循環(huán)左右。循環(huán)數(shù)太小，獲得的產(chǎn)物不夠，循環(huán)數(shù)太多浪費(fèi)時(shí)間，產(chǎn)物的特異性也不一定好，不是循環(huán)數(shù)越多越好。

注意事項(xiàng)：

1.變性溫度不能過(guò)高，會(huì)影響酶的活性，變性溫度低，解鏈不全，導(dǎo)致引物不能結(jié)合，得不到擴(kuò)增產(chǎn)物；

2.退火溫度與引物的 Tm 值有關(guān)；

3.依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼{(diào)整反應(yīng)體系，使得 PCR 過(guò)程經(jīng)濟(jì)、高效。