非特異性吸附是指在固液界面上，溶液中的待測化合物由于靜電作用、疏水作用等非共價鍵作用力，被吸附到固體表面的現(xiàn)象。非特異性吸附會影響樣品的真實(shí)濃度和分析結(jié)果的精確性，導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線的提取回收率不一致，出現(xiàn)高濃度點(diǎn)信號偏高，低濃度點(diǎn)信號偏低的情況。此外，它還會影響色譜峰型和產(chǎn)生進(jìn)樣殘留，從而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

避免ELISA實(shí)驗(yàn)中的非特異性吸附，可以采取以下策略：

一、封閉步驟優(yōu)化

1、?封閉劑選擇

優(yōu)先使用1-5% BSA（牛血清白蛋白）或5%脫脂奶粉，封閉未結(jié)合位點(diǎn)。

對高背景樣本可嘗試?yán)业鞍祝?/span>1%濃度）或商業(yè)封閉緩沖液。

2、?封閉條件控制

37℃封閉1-2小時或4℃過夜，確保充分覆蓋孔板表面。

封閉液需與樣本基質(zhì)匹配（如血清樣本建議用含0.05% Tween-20的PBS）?。

二、樣品處理與稀釋

1、優(yōu)化樣品稀釋：使用含0.5%-1%牛血清白蛋白（或0.1%白明膠）的溶液稀釋檢測血清和酶標(biāo)記抗體，能增強(qiáng)特異性吸附。樣品首先用稀釋的健血清孵育，也有助于去除非特異性顯色。

2、控制酶標(biāo)記抗體濃度：酶標(biāo)記抗體濃度太高易出現(xiàn)假陽性，太低則不靈敏，需通過實(shí)驗(yàn)確定待測樣品、酶標(biāo)記抗體和抗抗體的最適濃度。

三、緩沖液與洗滌優(yōu)化

1、合理使用添加劑：在洗滌液或稀釋液中添加吐溫20，其為非離子型表面張力物質(zhì)，常用含吐溫20的PBS作洗滌劑或稀釋樣品和酶標(biāo)抗體，使用量一般在0.06%-0.1%，洗滌效果比牛血清蛋白溶液（0.5%）好，能減少非特異性吸附并增強(qiáng)抗原抗體結(jié)合。

2、規(guī)范洗滌操作：正確的洗滌是保證ELISA結(jié)果可重復(fù)的關(guān)鍵步驟，無論是手工還是機(jī)器操作，都要通過洗滌消除殘留在板孔中未結(jié)合的物質(zhì)及非特異性吸附的干擾物質(zhì)，以達(dá)到分離游離和結(jié)合酶標(biāo)記物的目的。

四、更換試劑或材料

如果懷疑是抗體或固相材料的問題，可以嘗試更換不同的抗體或使用不同材質(zhì)的96孔板，以減少非特異性吸附。例如，如果使用的是玻璃基質(zhì)的芯片，可以考慮更換為海藻酸基質(zhì)的芯片，因?yàn)槟承┕滔嗖牧峡赡苡啥鄬踊|(zhì)組成，不同的材質(zhì)可能會影響非特異性結(jié)合。

五、提高分析物的純度

盡可能去除分析物中的雜質(zhì)，通過提高分析物的純度、使用高質(zhì)量的緩沖試劑或?qū)Υ謽悠愤M(jìn)行處理（如離心）來減少非特異性結(jié)合。

六、實(shí)驗(yàn)操作條件控制

1、控制溫育條件：反應(yīng)一般需在25℃下進(jìn)行4-5h，若要減少反應(yīng)時間可升至37℃，雖對靈敏性和準(zhǔn)確性稍有影響，但能將保溫時間縮短至2-3h，對結(jié)果影響不大，37℃因此被經(jīng)常采用。同時，要嚴(yán)格按照試劑最佳反應(yīng)模式控制溫育溫度和時間。

2、規(guī)范加樣操作：加樣時應(yīng)將所加物加在ELISA板孔底部，避免加在孔壁上部，防止濺出和產(chǎn)生氣泡。對于間接ELISA標(biāo)本，稀釋時要保證加樣準(zhǔn)確，尤其稀釋倍數(shù)大時，很小的絕對誤差會導(dǎo)致較大相對誤差。

3、確保酶標(biāo)儀性能穩(wěn)定：酶標(biāo)儀作為記錄測定結(jié)果的儀器，其性能穩(wěn)定與否決定結(jié)果的可靠度，需保證其處于良好工作狀態(tài)。

通過這些方法的綜合應(yīng)用，可以有效地減少ELISA實(shí)驗(yàn)中的非特異性吸附，提高實(shí)驗(yàn)的特異性和準(zhǔn)確性。