血漿蛋白組學(xué)作為挖掘疾病標(biāo)志物、推動(dòng)藥物研發(fā)的關(guān)鍵方向，近年來卻受困于一大核心瓶頸 —— 基于質(zhì)譜的高通量檢測(cè)中，蛋白定量穩(wěn)定性不足，直接導(dǎo)致血漿大隊(duì)列實(shí)驗(yàn)難以推進(jìn)，嚴(yán)重延緩了科研成果向臨床的轉(zhuǎn)化。即便賽默飛 Orbitrap Astral、布魯克 Tims TOF 等新一代高分辨質(zhì)譜儀性能大幅升級(jí)，流程不標(biāo)準(zhǔn)、前處理不統(tǒng)一、數(shù)據(jù)分析不一致的問題仍未解決，不同儀器數(shù)據(jù)無法聯(lián)通，數(shù)據(jù)孤島、結(jié)果難復(fù)現(xiàn)等難題依舊突出。而珞米生命科技 Proteonano™蛋白組學(xué)前處理分析系統(tǒng)的出現(xiàn)，正為突破這一困境而來。本文以健康人混合血漿為樣本，評(píng)估其在不同質(zhì)譜儀上的表現(xiàn)，力求為高通量血漿蛋白組學(xué)建立標(biāo)準(zhǔn)流程，為標(biāo)志物轉(zhuǎn)化提供新可能。

 Proteonano™ 系統(tǒng)適配三款質(zhì)譜儀全流程

前處理試劑盒和測(cè)試樣本信息

Proteonano™ 平臺(tái)在不同質(zhì)譜儀上的表現(xiàn)

蛋白鑒定數(shù)和動(dòng)態(tài)范圍

TimsTOF Pro 2 雖然梯度時(shí)間較長(zhǎng)，但相對(duì)于 Orbitrap Exploris 480 具有更高的蛋白鑒定能力，同時(shí)，進(jìn)樣量更低有利于降低實(shí)驗(yàn)成本。Orbitrap Astral 梯度時(shí)間短，蛋白鑒定能力強(qiáng)，相對(duì)于 Orbitrap Exploris 480和 TimsTOF Pro 2，在蛋白鑒定能力上與 Proteonano™ Kit 試劑盒及 Lite Suite 高通量蛋白組學(xué)分析系統(tǒng)更適配。

各個(gè)質(zhì)譜平臺(tái)鑒定結(jié)果的 CV 值在 0.25%~1.47%，CV 值分析均表現(xiàn)出數(shù)據(jù)結(jié)果具有高穩(wěn)定性。同時(shí)，Proteonano™在三個(gè)不同的平臺(tái)上，檢測(cè)到的蛋白豐度范圍均超過了 8 個(gè)數(shù)量級(jí)，相比傳統(tǒng)方法只有 3-5 個(gè)數(shù)量級(jí)，鑒定深度提升了接近 10000 倍。

定量穩(wěn)定性：蛋白強(qiáng)度定量中位數(shù) CV 值 <15%

我們進(jìn)一步探討了 Proteonano™ Platform 在不同高分辨質(zhì)譜儀上蛋白檢測(cè)定量的穩(wěn)定性。在 Orbitrap Astral、Orbitrap 480、timsTOF Pro2 上面，中位數(shù) CV 值從 8.1% 到 12.7%。同時(shí)我們也看到，在 Orbitrap Astral 180SPD 和 100SPD 下，其中位數(shù) CV 值位于 10% 以下，也進(jìn)一步證實(shí)了這款由 Thermo Fisher 在 2013 年發(fā)布的新款高分辨質(zhì)譜儀在數(shù)據(jù)采集穩(wěn)定性方面的提升。

覆蓋 HPPP（人類血漿蛋白組數(shù)據(jù)庫）比例

我們把不同質(zhì)譜平臺(tái)（Orbitrap Exploris 480、TimsTOF Pro 2 和 Orbitrap Astral）鑒定到的蛋白與人類血漿蛋白組數(shù)據(jù)庫（Human Plasma Proteome Project, HPPP）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析。結(jié)果顯示（見圖五），基于Proteonano™ 平臺(tái)在 Orbitrap Astral、Orbitrap 480、timsTOF Pro2 上可檢測(cè)到的蛋白質(zhì)覆蓋 HPPP 數(shù)據(jù)庫中大約 50% 的蛋白質(zhì)，其中有 1690 種蛋白被三個(gè)質(zhì)譜儀同時(shí)檢測(cè)到。這也體現(xiàn)了不同質(zhì)譜儀之間存在的差異和互補(bǔ)性。

不同質(zhì)譜平臺(tái)之間的相關(guān)性

我們對(duì)質(zhì)譜平臺(tái)（TimsTOF Pro 2和Orbitrap Astral）均鑒定到的2497 個(gè)蛋白進(jìn)行Pearson 相關(guān)系數(shù)計(jì)算，以評(píng)估兩個(gè)平臺(tái)的檢測(cè)一致性，其中 Intensity TOP20 的蛋白已經(jīng)被剔除。

結(jié)論

（1）Proteonano™平臺(tái)具有優(yōu)秀的的通用性：在 Orbitrap Exploris 480、TimsTOF Pro 2、Orbitrap Astral 上都實(shí)現(xiàn)了超多重深度血漿蛋白組實(shí)驗(yàn)，蛋白鑒定數(shù)量位于 2000 到 4000 之間，且蛋白數(shù)量差異值小于 5%。

（2）Proteonano™平臺(tái)具有優(yōu)秀的蛋白定量準(zhǔn)確性：在三款高分辨質(zhì)譜儀上的蛋白鑒定定量 CV 值均小于15%，能夠確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，進(jìn)一步說明 Proteonano™系統(tǒng)具有高靈敏度、高可重復(fù)性的優(yōu)勢(shì)。

（3）Proteonano™平臺(tái)具有高度的標(biāo)準(zhǔn)化：在三款高分辨質(zhì)譜儀上均采用了自動(dòng)化、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臄?shù)據(jù)庫（Swiss-Prot）和數(shù)據(jù)分析流程，保證了結(jié)果的可靠性和可標(biāo)準(zhǔn)化。

綜上所述，Proteonano™高通量超多重蛋白組學(xué)分析系統(tǒng)在不同質(zhì)譜平臺(tái)用于血漿蛋白組學(xué)分析應(yīng)用中，均展現(xiàn)出了優(yōu)異的準(zhǔn)確性和靈敏度，為高通量血漿蛋白組學(xué)在不同質(zhì)譜儀上建立標(biāo)準(zhǔn)分析流程，為多重蛋白標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)和轉(zhuǎn)化提供可行性方案。