蛋白質(zhì)含量的測定原理及操作方法！

蛋白質(zhì)含量的測定原理及操作方法！

百歐博偉生物 衡量食品的營養(yǎng)成分時，要測定蛋白質(zhì)含量，但由于蛋白質(zhì)組成及其性質(zhì)的復雜性，在食品分析中，通常用食品的總氮量表示，蛋白質(zhì)是食品含氮物質(zhì)的主要形式，每一蛋白質(zhì)都有其恒定的含氮量，用實驗方法求得某樣品中的含氮量后，通過一定的換算系數(shù)。即可計算該樣品的蛋白質(zhì)含量。

一般食品蛋白質(zhì)含氮量為l0％如肉、蛋、豌豆、玉米等，其換算系數(shù)為6.25，小麥取5.70，大米5.95、乳制品6.38、大豆5.17，動物膠5.55。

一、目的與要求：

掌握微量凱氏法測定蛋白質(zhì)總氮量的原理及操作技術(shù)。包括樣品的消化，蒸餾吸收及滴定與含氮量的計算。

二、原理：

凱氏定氮法：食品經(jīng)加硫酸消化使蛋白質(zhì)分解，其中氮素與硫酸化合成硫酸銨。然后加堿蒸餾使氨游離，用硼酸液吸收后，再用鹽酸或硫酸滴定根據(jù)鹽酸消耗量，再乘以一定的數(shù)值即為蛋白含量，其化學反應式如下。

(1)2NH2(CH2)2COOH+13H2S04    (NH4)2S04+6C02+12S02+  16H2

(2)(NH4)2SO4+2NAOH-----2NH2+2H2O+NA2SO4

(3)2NH3+4H3BO3----(NH4)2B4O7+5H2O

(4)(NH4)2B407+H2S04+5H20-(NH4)9SO4+4H2BO2

三、試劑與儀器：

⒈硫酸鉀

⒉硫酸銅  

⒊硫酸

⒋2％硼酸溶液

⒌40％*溶液

⒍混合指示劑：把溶解于95％乙醇的0.l％溴甲酚綠溶液10毫升和溶于95％乙醇的0.l％甲基紅溶液2毫升混合而成．

⒎0.OINHCL標準溶液或0．01N硫酸標準溶液．

⒏凱氏微量定氮儀一套。

⒐定氮瓶100m1或50ml一只。

⒑三角瓶150ml 3只。

⒒量筒50ml、lOml、lOOml。

⒓吸量管10ml只。

⒔酸式滴定管1支。

⒕容量瓶100毫升1只。

⒖小漏斗1只。

四、操作方法：

⒈樣品處理：精密稱取0.2-2.0g固體樣品或2-5g半固體樣品或吸取10-20ml液體樣品（約相當?shù)?0-40mg），移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸銅，3g硫酸鉀及20毫升硫酸，稍搖勻后于瓶口放一小漏斗，將瓶以45度角斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上，小火加熱，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫*停止后，加強火力，并保持瓶內(nèi)液體微沸，至液體呈藍綠色澄清透明后，再繼續(xù)加熱0.5小時。取下放冷，小心加20ml水，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。取與處理樣品相同量的硫酸銅、硫酸鉀、硫酸銨同一方法做試劑空白試驗。

⒉按圖裝好定氮裝置，于水蒸氣發(fā)生器內(nèi)裝水約2/3處加甲基紅指示劑數(shù)滴及數(shù)毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入數(shù)粒玻璃珠以防暴沸，用調(diào)壓器控制，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)的水。

⒊想接收瓶內(nèi)加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示劑1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml樣品消化液由小玻璃杯流入反應室，并以10ml水洗滌小燒杯使流入反應室內(nèi)，塞緊小玻璃杯的棒狀玻璃塞。將10ml 40%*溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其緩慢流入反應室，立即將玻璃蓋塞緊，并加水于小玻璃杯以防漏氣。夾緊螺旋夾，開始蒸餾，蒸氣通入反應室使氨通過冷凝管而進入接收瓶內(nèi)，蒸餾5min。移動接收瓶，使冷凝管下端離開液皿，再蒸餾1min，然后用少量水沖洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.01N硫酸或0.01N鹽酸標準溶液定至灰色或藍紫色為終點。

同時吸取10.0ml試劑空白消化液按3操作。

計算：

X =(（V1-V2）*N*0.014)/( m*（10/100）) +F*100　

X：樣品中蛋白質(zhì)的含量，g；

V1：樣品消耗硫酸或鹽酸標準液的體積，ml；

V2：試劑空白消耗硫酸或鹽酸標準溶液的體積，ml；

N：硫酸或鹽酸標準溶液的當量濃度；

0.014：1N硫酸或鹽酸標準溶液1ml相當于氮克數(shù)；

m：樣品的質(zhì)量（體積），g（ml）；

F：氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。

注：

（1）樣品應是均勻的，固體樣品應預先研細混勻，液體樣品應振搖或攪拌均勻。

（2）樣品放入定氮瓶內(nèi)時，不要沾附頸上，萬一沾附可用少量水沖下，以免被檢樣消化不*，結(jié)果偏低。

（3） 消化時如不容易呈透明溶液，可將定氮瓶放冷后，慢慢加入30%*2-3ml，促使氧化。

（4）在整個消化過程中，不要用強火，保持和緩的沸騰，使火力集中在凱氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白質(zhì)在無硫酸存在的情況下。使氮有損失。

（5）如硫酸缺少，過多的硫酸鉀會引起氨的損失，這樣會形成硫酸氫鉀，而不與氨作用，因此當硫酸過多的被消耗或樣品中脂肪含量過高時，要增加硫酸的量。

（6）加入硫酸鉀的作用為增加溶液的沸點，硫酸銅為催化劑，硫酸銅在蒸餾時作堿性反應的指示劑。

（7）混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。如果沒有溴甲酚綠，可單獨使用0.1%甲基紅乙醇溶液。

（8）氨是否*蒸餾出來，可用PH試紙試餾出液是否為堿性。

（9）吸收葉也可以用0.01當量的酸代表硼酸，過剩的酸液用0.01N堿液滴定，計算時，A為試劑空白消耗堿液數(shù)，B為樣品消耗堿液數(shù)，N為堿液濃度，其余均相同。

（10）以硼酸為氨的吸收液，可省去標定堿液的操作，且硼酸的體積要求并不嚴格，亦可免去用移液管，操作比較簡便。

（11）向蒸餾瓶中加入濃堿時，往往出現(xiàn)褐色沉淀物，這是由于分解促進堿與加入的硫酸銅反應，生成氫氧化銅，經(jīng)加熱后又分解生成氧化銅的沉淀。有時銅離子與氨作用，生成深蘭色的結(jié)合物[Cu(NH3)4]++

百歐博偉生物（biobw）是北京的一家專業(yè)于生物技術(shù)的研究與廣泛運用及推廣的高科技公司，位于北京企業(yè)林立的豐臺區(qū)造甲街，生物技術(shù)推廣及運用早于2011年開始，成立公司于2013年一月。本公司主要提供色譜耗材、色譜儀器、固相萃取裝置、化學試劑、樣品瓶、氘燈、標準品、微生物技術(shù)、菌種保藏服務以及ATCC產(chǎn)品代理等產(chǎn)品及服務。