天根試劑盒-細(xì)菌基因組 DP302

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

    細(xì)菌基因組 DP302采用離心吸附柱和緩沖液系統(tǒng)，既適用于革蘭氏陰性菌基因組DNA的提取，也可適用于革蘭氏陽(yáng)性菌基因組DNA的提取。

    本試劑盒也可用于食品致病菌(微生物) 基因組提取，如：、霍亂弧菌、出血性大腸桿 菌O157：H7、單增李斯特、沙門(mén)氏菌、阪崎腸肝菌等?？蓮?-5 ml細(xì)菌培養(yǎng)液中，快速提取純化10-40 μg 純凈的基因組DNA，所得基因組DNA可直接用作PCR 模板、酶切、雜交等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

產(chǎn)品特點(diǎn)

■ 簡(jiǎn)單快速：革蘭氏陰性菌在1小時(shí)內(nèi)可獲得高質(zhì)量的基因組DNA。

■ 質(zhì)量好：DNA可直接用于PCR、酶切、雜交等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

下游應(yīng)用

■ 革蘭氏陰性菌基因組提取。

■ 革蘭氏陽(yáng)性菌基因組提取。

■ 食品中致病菌基因組提取。

自備試劑

( 革蘭氏陽(yáng)性菌)、緩沖液(20 mM Tris, pH8.0; 2 mM Na2-EDTA; 1.2%Triton-100 )

注意事項(xiàng) 

請(qǐng)務(wù)必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項(xiàng)。

 1．樣品應(yīng)避免反復(fù)凍融，否則會(huì)導(dǎo)致提取的DNA片段較小且提取量也下降。

 2．若緩沖液GA或GB中有沉淀，可在37℃水浴中重新溶解，并搖勻后使用。

 3．所有的離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)，室溫下離心。

操作步驟 使用前請(qǐng)先在緩沖液GD和漂洗液PW中加入CH3CH2OH，加入體積請(qǐng)參照瓶上的標(biāo)簽。

 1. 取細(xì)菌培養(yǎng)液1-5 ml，10,000 rpm(~11,500×g)離心1 min，盡量吸凈上清。

 2. 向菌體沉淀中加入200 μl緩沖液GA，振蕩至菌體懸浮。

 注意：對(duì)于較難破壁的革蘭氏陽(yáng)性菌，可略過(guò)第2步驟，加入溶液進(jìn)行破壁處 理。

具體方法為：加入110 µl緩沖液（20 mM Tris, pH 8.0；2 mM Na2-EDTA；1.2% Triton），和70 µl溶液（50 mg/ml，客戶(hù)自備，目錄號(hào)：RT401），37 ℃處理30 min以上。如果需要去除RNA，可加入4 μl RNase A（100 mg/ml）溶液（客戶(hù)自備，目 錄號(hào)：RT405-12），振蕩15 sec，室溫放置5 min。 

3. 向管中加入20 μl Proteinase K溶液，混勻。 

4. 加入220 μl緩沖液GB，振蕩15 sec，70 ℃放置10 min，溶液應(yīng)變清亮，簡(jiǎn)短離心以去除 管蓋內(nèi)壁的水珠。

 注意：加入緩沖液GB時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生白色沉淀，一般70℃放置時(shí)會(huì)消失，不會(huì)影響后續(xù)實(shí) 驗(yàn)。

如溶液未變清亮，說(shuō)明細(xì)胞裂解不，可能導(dǎo)致提取DNA量少和提取出的DNA不 純。 

5. 加220 μl CH3CH2OH，充分振蕩混勻15 sec，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。

6. 將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中）， 12,000 rpm (~13,400×g ) 離心30 sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。 

7. 向吸附柱CB3中加入500 μl緩沖液GD，12,000 rpm (~13,400×g ) 離心30 sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。 

8. 向吸附柱CB3中加入600 μl漂洗液PW，12,000 rpm (~13,400×g ) 離心30 sec，倒掉廢液，吸附柱CB3放入收集管中。

9. 重復(fù)操作步驟8。 

10. 將吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm(~13,400×g)離心2 min，倒掉廢液。

將吸附柱 CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

 注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，漂洗液中的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切、PCR等）實(shí)驗(yàn)。 

11. 將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200 μl洗脫緩 沖液TE，室溫放置2-5 min，12,000 rpm (~13,400×g ) 離心2 min，將溶液收集到離心管 中。

 注意：洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50 μl，體積過(guò)小影響回收效率。洗脫液的pH值對(duì)于 洗脫效率有較大影響。

若用ddH2O做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)，pH值低 于7.0會(huì)降低洗脫效率；且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防DNA降解。

    為增加基因組 DNA的得率，可將離心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室溫放置2 min，12,000 rpm(~13,400×g )離心2 min。

 DNA濃度及純度檢測(cè)

    得到的基因組DNA片段的大小與樣品保存時(shí)間、操作過(guò)程中的剪切力等因素有關(guān)?；厥盏玫降腄NA片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度。 DNA應(yīng)在OD260處有吸收峰，OD260值為1相當(dāng)于大約50 μg/ml雙鏈DNA、40 μg/ml 單鏈DNA。 OD260/OD280比值應(yīng)為1.7-1.9，如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液，而使用ddH2O，比值會(huì)偏 低，因?yàn)閜H值和離子存在會(huì)影響光吸收值，但并不表示純度低。