p0017s快速銀染試劑盒

碧云天快速銀染試劑盒SDS-PAGE蛋白染色p0017s(Fast Silver Stain Kit)是一種快速簡(jiǎn)單、可用于SDS-PAGE或非變性PAGE等蛋白銀染的試劑盒。本試劑盒也可以用于2D凝膠的銀染，并且染色后和后續(xù)的質(zhì)譜檢測(cè)兼容。

圖1. 本試劑盒PAGE膠銀染效果圖。BSA(左圖)和Hela細(xì)胞裂解液(右圖)在SDS-PAGE后使用本試劑盒進(jìn)行銀染的效果圖。左側(cè)泳道均為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。左圖為獲得較高的檢測(cè)靈敏度，顯色時(shí)間較長(zhǎng)，已經(jīng)產(chǎn)生了橙黃色的背景；右圖顯色時(shí)間較短，僅出現(xiàn)淺土黃色的背景。

本試劑盒可足夠用于25塊常規(guī)的8×10cm凝膠的銀染。
包裝清單：

保存條件：

室溫保存，一年有效。銀溶液(100X)和銀染顯色加速液(2000X)需避光保存。
注意事項(xiàng)：
  由于銀染靈敏，操作時(shí)請(qǐng)注意盡量使用高純度的水，并確保所使用的器皿非常清潔，使用潔凈的玻璃器皿。操作時(shí)必須戴手套，避免皮膚和凝膠直接接觸。
  下述使用說(shuō)明中各種溶液的使用量適用于大小為8×10cm厚度為0.75-1mm的凝膠。對(duì)于更大的凝膠，各種溶液的使用量需按凝膠面積的比例放大，對(duì)于更厚的凝膠，作用時(shí)間需按照厚度的比例適當(dāng)延長(zhǎng)。
  本說(shuō)明書(shū)所指的室溫為20-25℃，操作溫度較低時(shí)由于溶液的擴(kuò)散能力下降，各步驟需適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。
銀染基本顯色液(5X)在低溫環(huán)境下可能會(huì)出現(xiàn)少量沉淀，可在30-50℃水浴中溶解，并充分混勻后使用。至少后續(xù)稀釋至1X后須確保溶解。

使用說(shuō)明：
1. 固定：
電泳結(jié)束后，取凝膠放入約100ml固定液中，在搖床上室溫?fù)u動(dòng)20分鐘，搖動(dòng)速度為60-70rpm。固定 40分鐘以上甚至過(guò)夜可以進(jìn)一步降低背景。
固定液的配制：依次加入50ml乙醇、10ml乙酸和40ml Milli-Q級(jí)純水或雙蒸水，混勻后即成100ml固 定液。
2. 30%乙醇洗滌：
棄固定液，加入100ml 30%乙醇，在搖床上室溫?fù)u動(dòng)10分鐘，搖動(dòng)速度為60-70rpm。
30%乙醇的配制：70ml Milli-Q級(jí)純水或雙蒸水中加入30ml乙醇，混勻后即成100ml 30%乙醇。
3. 水洗滌：
棄30%乙醇，加入200ml Milli-Q級(jí)純水或雙蒸水，在搖床上室溫?fù)u動(dòng)10分鐘，搖動(dòng)速度為60-70rpm。如果本步驟用水洗滌更長(zhǎng)時(shí)間，對(duì)降低染色的背景略有幫助。
4. 增敏：
棄水，加入100ml銀染增敏液(1X)，在搖床上室溫?fù)u動(dòng)2分鐘，搖動(dòng)速度為60-70rpm。
銀染增敏液(1X)的配制：99ml Milli-Q級(jí)純水或雙蒸水中加入1ml銀染增敏液(100X)，混勻后即為銀 染增敏液(1X)。銀染增敏液(1X)配制后需在2小時(shí)內(nèi)使用。
5. 水洗滌(共2次)：
棄原有溶液，加入200ml Milli-Q級(jí)純水或雙蒸水，在搖床上室溫?fù)u動(dòng)1分鐘，搖動(dòng)速度為60-70rpm。
棄水，再加入200ml Milli-Q級(jí)純水或雙蒸水，在搖床上室溫?fù)u動(dòng)1分鐘，搖動(dòng)速度為60-70rpm。
6. 銀染：
棄水，加入100ml銀溶液(1X)，在搖床上室溫?fù)u動(dòng)10分鐘，搖動(dòng)速度為60-70rpm。
銀溶液(1X)的配制：99ml Milli-Q級(jí)純水或雙蒸水中加入1ml銀溶液(100X)，混勻后即為銀溶液 (1X)。銀溶液(1X)配制后需在2小時(shí)內(nèi)使用。
7. 水洗滌：
棄原有溶液，加入100ml Milli-Q級(jí)純水或雙蒸水，在搖床上室溫?fù)u動(dòng)1-1.5分鐘，搖動(dòng)速度為 60-70rpm。
注意：水洗滌的時(shí)間不能超過(guò)1.5分鐘。
8. 顯色：
棄水，加入100ml銀染顯色液，在搖床上室溫?fù)u動(dòng)3-10分鐘，直至出現(xiàn)比較理想的預(yù)期蛋白條帶，搖 動(dòng)速度為60-70rpm。
銀染顯色液的配制：80ml Milli-Q級(jí)純水或雙蒸水中加入20ml銀染基本顯色液(5X),再加入0.05ml銀 染顯色加速液(2000X)，混勻后即為銀染顯色液。銀染顯色液配制后需在20分鐘內(nèi)使用。
9. 終止：
棄銀染顯色液，加入100ml銀染終止液(1X)，在搖床上室溫?fù)u動(dòng)10分鐘，搖動(dòng)速度為60-70rpm。終止 時(shí)有氣體產(chǎn)生屬正?，F(xiàn)象，產(chǎn)生的氣體為二氧化碳。
銀染終止液(1X)的配制：95ml Milli-Q級(jí)純水或雙蒸水中加入5ml銀染終止液(20X),混勻后即為銀染 終止液(1X)。銀染終止液(1X)配制后宜當(dāng)天使用。
10. 水洗滌：
棄銀染終止液，加入100ml Milli-Q級(jí)純水或雙蒸水，在搖床上室溫?fù)u動(dòng)2-5分鐘，搖動(dòng)速度為 60-70rpm。
11. 保存：
可在Milli-Q級(jí)純水或雙蒸水中保存?；虿捎眠m當(dāng)?shù)姆绞街苽涑筛赡z。

常見(jiàn)問(wèn)題：
1. 背景太深：
a. 顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。通常顯色反應(yīng)會(huì)在10分鐘內(nèi)結(jié)束，顯色反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致背景很深。
b. 洗滌不充分。洗滌時(shí)間過(guò)短，或洗滌液加入的量不足，或者容器過(guò)于狹小導(dǎo)致?lián)u動(dòng)時(shí)溶液不易充分混合，或搖動(dòng)速度過(guò)慢，導(dǎo)致混勻不充分。請(qǐng)按照說(shuō)明書(shū)的建議確保各種溶液的用量和作用時(shí) 間，搖床的推薦速度為60-70rpm。
c. 凝膠中原有的緩沖液等未在固定步驟中去除干凈。一方面需確保固定的時(shí)間和固定液的用量，另 一方面對(duì)于不是常用的Bis-Tris緩沖的凝膠需要更長(zhǎng)的固定時(shí)間以充分去除凝膠中的原有緩沖成分，以降低背景。
d. 水的純度太低。需使用大于16 MΩ. cm的高*純度水。
2. 蛋白條帶淺：
a. 蛋白的半(Cysteine)殘基的含量低或幾乎沒(méi)有。半殘基的存在對(duì)于銀染很重要，半殘基的含量過(guò)低會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度下降。
b. 銀染后水洗滌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。在銀溶液染色時(shí)需嚴(yán)格控制水洗滌的時(shí)間，水洗滌的時(shí)間不能超過(guò)1.5分 鐘，否則會(huì)導(dǎo)致過(guò)多的銀離子被洗去，導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度下降。
c. 上樣量不足。本試劑盒檢測(cè)BSA的靈敏度可以達(dá)到0.3ng，對(duì)于不同的蛋白檢測(cè)靈敏度可能不同。 對(duì)于一些蛋白可能需要大于1ng的蛋白量才能被檢測(cè)到。
d. 固定步驟后的洗滌不夠充分。確保洗滌和水洗滌的用 量和時(shí)間，可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間。
3. 凝膠上出現(xiàn)小點(diǎn)或或其它非蛋白的痕跡：
a. 凝膠沒(méi)有充分被溶液浸沒(méi)。請(qǐng)注意選擇大小合適的容器，并加入足量的各種溶液，同時(shí)需保持適 當(dāng)?shù)幕靹蛩俣却_保凝膠可以被溶液浸沒(méi)。
b. 用于銀染的容器沒(méi)有充分洗滌干凈。容器需先用洗滌劑充分洗滌，隨后用自來(lái)水充分沖洗，再用高純度水再洗滌數(shù)次。該容器能用于銀染，并注意避免各種可能的蛋白污染。為確保充 分洗滌干凈，對(duì)于耐化學(xué)腐蝕的容器，例如玻璃容器。
c. 指紋或其它壓痕。請(qǐng)注意戴手套操作，切勿直接接觸皮膚。操作時(shí)請(qǐng)注意盡量勿擠壓、折疊或摩 擦凝膠。
d. 有金屬物質(zhì)接觸凝膠。金屬物質(zhì)例如金屬鑷子等接觸凝膠會(huì)出現(xiàn)非特異性痕跡。
4. 在60-70 kD處出現(xiàn)一片模糊的蛋白染色背景：
皮膚上脫落的角蛋白(keratin)污染了蛋白樣品。一方面需注意戴手套操作，另一方面需注意盛放蛋 白樣品的容器蓋子盡量不要敞開(kāi)，甚至在取放蛋白樣品時(shí)在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行以避免可能的角蛋白污染。
5. 在凝膠的頂端處出現(xiàn)黃色背景：
a. 樣品中DTT濃度高。采用其它適當(dāng)?shù)倪€原試劑，或者在許可范圍內(nèi)適當(dāng)減少DTT的用量。
b. 采用Tris-Glycine-SDS電泳體系。Tris-Glycine-SDS電泳體系中的Glycine會(huì)導(dǎo)致背景凝膠的頂端 出現(xiàn)輕微的黃色背景。換用Tris-Tricine-SDS電泳體系則可顯著消除此黃色背景。
6. 銀在染色器皿中出現(xiàn)沉淀：
染色器皿中可能含有殘余的洗滌劑或上次銀染時(shí)的殘余試劑。需確保把染色器皿洗滌干凈。

其他蛋白相關(guān)試劑盒：