試劑盒elisa（HRP 標(biāo)記抗小鼠，TMB 顯色反 應(yīng)）

 貨號 規(guī)格 BF06124-2 20*96 

產(chǎn)品介紹 

ELISA 通用試劑盒是一種通用的酶聯(lián)免疫（ELISA）檢測抗原或抗體的試劑盒，含有 ELISA 實驗所必須的通用試劑組份，試劑盒elisa對反應(yīng)條件、操作步驟、各試劑的濃度進行了優(yōu)化， 保證了檢測結(jié)果的靈敏度和重復(fù)性。

 本試劑盒可用于檢測小鼠的抗體。適用于初次接觸 ELISA 技術(shù)的實驗者，或者為節(jié)省 時間并保證檢測結(jié)果具有高靈敏和可重復(fù)性的科研工作者。

 1.試劑盒組分 

1.1. 包被緩沖液（10×濃縮） 25ml ×1 瓶 

1.2. BSA 封閉液（10×濃縮）100ml ×1 瓶 

1.3. 洗滌緩沖液（20×濃縮）250ml ×1 瓶 

1.4. 可溶性 TMB 單組分 250ml×1 瓶 

1.5. 終止液 120ml×1 瓶 

1.6. HRP 標(biāo)記抗小鼠 IgG (H+L)抗體：1 ml ×1 支(0.1mg/ml)

 儲存在 2～8℃，有效期 2 年，可以完成 20 塊 96 孔酶標(biāo)板檢測。

 2.試劑盒不提供的試劑或耗材 

2.1. 小鼠的一抗 

2.2. 親和層析純化的未標(biāo)記捕獲抗體 

2.3. 酶標(biāo)板（不建議用組織培養(yǎng)板） 

2.4. 吸水紙、毛巾或棉布 

2.5. 蒸餾水或純化水 

2.5. 移液器試劑瓶等 

2.6. 多通道排槍和加液槽 

2.7. 手套 

2.8. 槍頭 

3.檢測原理 

3.1 雜交瘤篩選 可以檢測雜交瘤培養(yǎng)液中的特異性抗體，使用適當(dāng)標(biāo)記二抗，可以檢測抗原特異性的小 鼠抗體。 

3.2 檢測抗原或抗體 

3.2.1 直接 ELISA：是檢測抗原的簡單方法，包被抗原，加標(biāo)記的檢測抗體。 

3.2.2 間接抗體 ELISA: 可以檢測抗原或抗體，取決于哪種是未知的。包被抗原，加一 抗或含抗體的血清或腹水，常用于檢測動物特異性抗體的水平，也可用于檢測雜交瘤培養(yǎng) 上清中的單克隆抗體。

 3.2.3 雙抗體夾心法：是檢測抗原的一種高度敏感性的方法。用高度純化的抗體分別作 為包被抗體和檢測抗體，檢測抗體可直接標(biāo)記酶，如果包被抗體和檢測抗體不是來源同種動物，檢測抗體也可不標(biāo)記，而加針對檢測抗體動物種屬的酶標(biāo)二抗，此法適用于抗原濃度過 低，不能直接包被到酶標(biāo)板上或者含有未知成分干擾的抗原檢測。

 4.確定反應(yīng)條件

 4.1 雜--交--瘤篩選用間接 ELISA 方法篩選抗體 

4.2 檢測抗原或抗體 

按照推薦的方法和步驟可以滿足大多數(shù)實驗的要求，反應(yīng)時間、溫度和試劑濃度等可以 根據(jù)實驗需要進行調(diào)整 每一步都應(yīng)該進行系統(tǒng)性評價以便獲得有利的實驗條件。試劑通過倍比稀釋以確定合適的濃度。選擇合適的濃度對照，以確定實驗中存在的問題，發(fā)現(xiàn)引起錯誤結(jié)果和高本底的原因。 確定實驗方案和樣品數(shù)量后，可以準備所需要的各種材料和試劑。實 驗前，建議所有的試劑恢復(fù)到室溫并混勻。 

4.3 檢測條件概述

 4.3.1 包被酶標(biāo)板多種包被條件：抗原或抗體濃度、pH、離子強度、溫度和孵育時間都影響包被效率。 此外， 結(jié)合蛋白的數(shù)量與分子量成反比。試劑盒中包被液為優(yōu)化的磷酸鹽緩沖液，適用于大 多數(shù)抗原和抗體的包被。微孔板應(yīng)選擇專用于 ELISA 的酶標(biāo)板，不建議使用組織培養(yǎng)板。 包被時，抗原或抗體在包被緩沖液中稀釋后加入到酶標(biāo)板中室溫孵育，盡可能使用最純的抗 原或抗體。一般來說 1～10μg/ml 室溫 1 小時能夠包被飽和。為方便，2～8℃過夜可以到較為滿意的包被效果。 包被后，酶標(biāo)板用 BSA 稀釋/封閉液封閉 45 分鐘，稀釋/封閉液中含 3%BSA，能夠通過封閉未反應(yīng)部位減少非特異性結(jié)合并保護包被上的蛋白質(zhì)活性。如果暫時 不繼續(xù)實驗，可以用塑料膜覆蓋酶標(biāo)板后冷藏保存，需要時再恢復(fù)室溫繼續(xù)實驗。

 4.3.2 洗板 加標(biāo)本和酶標(biāo)抗體后需要洗滌，通過洗滌可以去掉未反應(yīng)試劑幫助降低本底。洗滌方法是孔與孔之見均勻一致并且沒有液體的相互污染。洗滌時將板子翻轉(zhuǎn)并將液體甩掉拍 凈。洗滌液中含有 0.1%吐溫-20 以抑制非特異性結(jié)合。如果實驗過程中斷，應(yīng)該將酶標(biāo)板 中加入洗滌液以避免酶標(biāo)板干燥。 

4.3.3 HRP 標(biāo)記抗體 HRP 標(biāo)記的抗體作為檢測抗體，與底物反應(yīng)后，使底物顯色。實驗過程中避免接觸疊-氮鈉，疊-氮鈉可使 HRP 失活。 4.3.4 底物 使用 TMB 底物，一般來說，產(chǎn)生的顏色與待測物濃度呈正比。

 4.3.5 對照和標(biāo)本 每次實驗都要包含適當(dāng)?shù)膶φ找杂糜诜治鰴z測體系的效能。定量 ELISA 要以標(biāo)準品進 行比較。每次實驗要設(shè)以下對照： 4.3.6 本底對照：不加標(biāo)本，其它試劑都加，可以幫助分析非特異性本底的原因。將實 驗結(jié)果減去本底以保證實驗之間的可比性。

 4.3.7 陰性對照：加已知的陰性參考品。 

4.3.8 閾值對照：加弱陽性參考品用于確定陽性的臨界值。

 4.3.9 陽性對照：加強陽性參考品以確定線性信號。 對照和標(biāo)本都用 BSA 稀釋/封閉液進行稀釋以保證低本底，所有實驗盡量做雙份。

 5.試劑配制 

所有試劑當(dāng)日配制

 5.1 1X 包被液：用蒸餾水稀釋濃縮包被液（1ml 濃縮包被液+9ml 蒸餾水） 注意：如果在 10X 中出現(xiàn)結(jié)晶，加熱到室溫或 37℃混勻并再溶解。

 5.2 1X BSA 封閉液: 雜交瘤篩選：稀釋濃縮 BSA 稀釋/封閉液（1ml 濃縮 BSA 稀釋/封閉液+9ml 蒸餾水） 其它檢測：稀釋濃縮 BSA 稀釋/封閉液（1ml 濃縮 BSA 稀釋/封閉液+9ml 蒸餾水） 注意：如果在 10X 中出現(xiàn)結(jié)晶，加熱到室溫或 37℃混勻并再溶解。 

5.3 1X 洗滌液： 濃縮洗滌液 20 倍稀釋（1ml 濃縮洗滌液+19ml 蒸餾水）。稀釋的洗滌液室溫穩(wěn)定至少 6 個月。 

5.4 二抗工作液： 二抗?jié)饪s液濃度為 0.1mg/ml，2～8℃穩(wěn)定至少 1 年，使用前用 1X BSA 稀釋/封閉液稀 釋，對大多數(shù)實驗而言，0.1～2.0μg/ml 工作濃度。

 5.5 可溶性 TMB 單組分：直接使用。

 5.6 終止液：直接使用。 

5.7 標(biāo)本

 5.8 對照

 6.實驗優(yōu)化 

通過 3 個變量來優(yōu)化 ELISA 條件: 試劑濃度、溫度、孵育時間。一般情況下，室溫反 應(yīng)對大多數(shù)實驗?zāi)軌虻玫胶玫慕Y(jié)果。 優(yōu)化不同試劑濃度和不同孵育時間，選擇適宜的實 驗條件。在優(yōu)化濃度頂點時，一個 試劑倍比稀釋，然后另一個試劑倍比稀釋，每一孔都 對應(yīng)于前一個試劑和另一個試劑的某一個稀釋度的組合。 棋盤滴定確定試劑的適宜濃度。

•  1.加 100μl 稀釋液到 2～12 列的每孔。 
• 2.加 200μl 稀釋的試劑到列的每孔中。 
• 3.從第 1 列的孔中取 100μl 轉(zhuǎn)移到第二孔中，混勻用槍吹吸 3～5 次。 
• 4. 重復(fù)步驟 3 向后稀釋，一直到第 11 列，吸取第 11 列 100μl 棄去， 第 12 列作為 對照。 
•  5.重復(fù)以上的操作，從 A 排至 G 排, 稀釋另一個試劑，H 排作為對照。

 7.操作步驟 

7.1 瘤篩選包被液：在 1×包被液中稀釋抗原至合適的濃度（一般 1～10μg/ml）。

 一抗工作液：含有單克隆抗體的培養(yǎng)液。

 二抗工作液：取 25μl 的酶標(biāo)二抗稀釋到 5.0 ml 1X BSA 的稀釋/封閉液中或更大稀釋比 例。

 7.1.1 包被抗原 

• 1. 加抗原到酶標(biāo)板中。
• 2. 室溫孵育 1 小時。 
• 3. 甩掉板中液體并拍凈殘液，每孔加入洗滌液 200ul，洗滌 3 次并拍凈殘液。

 7.1.2 封閉酶標(biāo)板

 1.加 200 uL 1X BSA 稀釋/封閉液到每孔中。

 2. 孵育 30-45 分鐘, 甩掉板中液體并拍凈殘液，每孔加入洗滌液 200ul，洗滌 3 次并拍凈 殘液。

 7.1.3 與含單克隆抗體的培養(yǎng)液反應(yīng)

•  1.每孔中加 100 uL 含單克隆抗體的培養(yǎng)液。 
• 2. 室溫反應(yīng) 1 小時. 3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。 

7.1.4 洗板 

• 1. 加入 1X 洗滌液。
• 2. 甩掉板中液體并拍凈殘液。 
• 3. 重復(fù) 3～5 次。

 7.1.5 加二抗

•  1. 每孔加 100 uL 二抗。
•  2. 室溫反應(yīng) 1 小時。
•  3. 甩掉板中液體并拍凈殘液，洗板 3 次。 

7.1.6 顯色反應(yīng)

•  1. 每孔加 100 uL 底物，室溫反應(yīng) 1~ 15 分鐘。
•  2. 每孔加 50ul 終止液。 
• 3. 測 OD 值，檢測波長 450nm。

 7.2 直接 ELISA 抗原包被液：

將抗原稀釋在 1X 包被液中，濃度 1～10μg/ml。

 酶標(biāo)抗體：稀釋到 1X BSA 封閉液中，稀釋度參考條件優(yōu)化方法。

 7.2.1 加抗原 

• 1. 在酶標(biāo)板中每孔加入 100μl 抗原包被液。
•  2. 室溫孵育 1 小時。
•  3. 甩掉板中液體并拍凈殘液，每孔加入洗滌液 200ul，洗滌 3 次并拍凈殘液。

 7.2.2 封閉 

1. 每孔加 200μ1X BSA 封閉液。

 2. 37℃ 反應(yīng) 45 分鐘，甩掉板中液體并拍凈殘液，每孔加入洗滌液 200ul，洗滌 3 次并拍 凈殘液。 

7.2.3 加酶標(biāo)抗體 

• 1. 每孔加入 100 μl 酶標(biāo)抗體。
•  2. 室溫孵育 1 小時。 
• 3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

 7.2.4 洗板 

• 1. 加入 1X 洗滌液。
•  2. 甩掉板中液體并拍凈殘液。 
• 3. 重復(fù) 3～5 次。

 7.2.5 顯色反應(yīng)

•  1. 每孔加 100 uL 底物，室溫反應(yīng) 1~15 分鐘。 
• 2. 每孔加 50ul 終止液。 
• 3. 測 OD 值，檢測波長 450nm。

 7.3 間接抗體 ELISA 抗原包被液：將抗原稀釋在 1X 包被液中，濃度 1～10μg/ml。 

一抗/二抗工作液：將抗體稀釋到 1X BSA 稀釋/封閉液中，稀釋度參考條件優(yōu)化方法。

 7.3.1 加抗原

•  1. 在酶標(biāo)板中每孔加入 100μ 抗原包被液。 
• 2.室溫孵育 1 小時。 
• 3. 甩掉板中液體并拍凈殘液，每孔加入洗滌液 200ul，洗滌 3 次并拍凈殘液。 

7.3.2 封閉

 1. 每孔加 200μl 1X BSA 稀釋/封閉液。

 2. 反應(yīng) 30～45 分鐘，甩掉板中液體并拍凈殘液，每孔加入洗滌液 200ul，洗滌 3 次并拍凈 殘液。

 7.3.3 加一抗

 1. 每孔中加入 100μl 一抗 

2. 室溫反應(yīng) 1 小時 

3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。 

7.3.4 洗板

 1. 加入 1X 洗滌液。

 2. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

 3. 重復(fù) 3～5 次。 

7.3.5 加二抗

 1. 每孔加入 100μl 酶標(biāo)二抗。 

2. 室溫孵育 1 小時。 

3. 重復(fù) 3～5 次。

 7.3.6 顯色反應(yīng) 

1. 每孔加 100 uL 底物，室溫反應(yīng) 15 分鐘。

 2. 每孔加 50ul 終止液。 

3. 測 OD 值，檢測波長 450nm。

 7.4 雙抗體夾心 

ELISA 包被液：將抗體稀釋在 1X 包被液中，濃度 1～10μg/ml。 

抗原標(biāo)本：將抗原標(biāo)本稀釋到 1X BSA 稀釋/封閉液中。

 二抗工作液：將抗體稀釋到 1X BSA 封閉液中，稀釋度參考條件優(yōu)化方法。 

7.4.1 加捕獲抗體 

1. 在酶標(biāo)板中每孔加入 100μ 抗體包被液。

 2.室溫孵育 1 小時。

 3. 甩掉板中液體并拍凈殘液，每孔加入洗滌液 200ul，洗滌 3 次并拍凈殘液。 

7.4.2 封閉 

1. 每孔加 200μl 1X BSA 封閉液。 

2. 反應(yīng) 30～45 分鐘，甩掉板中液體并拍凈殘液，每孔加入洗滌液 200ul，洗滌 3 次并拍凈 殘液。

 7.4.3 加抗原

 1. 每孔中加入 100μl 標(biāo)本液

 2. 室溫反應(yīng) 1 小時直至過夜。

 3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。 

7.4.4 洗板 1. 加入 1X 洗滌液。

 2. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

 3. 重復(fù) 3～5 次。 

7.4.5 加標(biāo)記抗體 

1. 每孔加入 100μl 標(biāo)記二抗。

 2. 室溫孵育 1 小時。

 3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

 4. 重復(fù) 3～5 次。 

7.4.6 顯色反應(yīng)

 1. 每孔加 100 uL 底物，室溫反應(yīng) 15 分鐘。

 2. 每孔加 50ul 終止液。 

3. 測 OD 值，檢測波長 450nm。

 8.可能出現(xiàn)的問題和解決辦法

 8.1 以下結(jié)果表示實驗有效： 

陰性對照：無色 背景對照：OD 值低于 0.2 

閾值對照：中度顯色 強陽性對照：深度顯色，OD≥1.0 8.2 

希望增加特異性信號 

1. 增加酶標(biāo)抗體的濃度或延長孵育時間或提高孵育溫度。

 2. 延長底物的孵育時間。

 3. 增加包被抗原濃度或延長孵育時間。

 4. 用純化的抗原。

 5. 封閉時間縮短或增加 BSA 稀釋/封閉液的稀釋度。

 6. 減少洗板次數(shù)或操作更輕柔。

 8.3 減少非特異性信號

 1. 減少包被抗原濃度或縮短孵育時間。

 2. 減少酶標(biāo)抗體的濃度或縮短孵育時間或降低孵育溫度。

 3. 縮短底物的孵育時間。 

4. 增加洗板次數(shù)或延長洗滌液浸泡時間。

 5. 通過加低濃度包被抗原或捕獲抗體到稀釋的酶標(biāo)物中以減少結(jié)合物的交叉反應(yīng)。

 8.4. 背景忽高忽低，檢查洗板機功能是否正常。

 9. REFERENCES 1. Clark, B.R. and Engval, E. (1980). Enzyme Immunoassay, CRC Press, Inc., Boca Raton,FL. 2. Voller, A., Bidwell, D.E., and Bartlett, A. (1979). The Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), A Guide With Abstracts of Microplate Applications. Dynatech Laboratories Inc. Alexandria, VA. 3. Fleming, J.O. and Pen, L.B. (1988). J. Immunol. Methods, 1110: 11 – 18