脂肪間充質干細胞成軟骨誘導分化試劑盒

脂肪間充質干細胞成軟骨誘導分化試劑盒規(guī)格：

質檢標準 pH：7.2~7.4 

內毒素含量：＜10 EU/mL 

生物安全：細菌、真菌、支原體檢測陰性 

質量檢測：誘導測試合格

| 檢驗原理 

阿利辛藍廣泛用于酸性多糖的染色，如軟骨 或組織中的糖胺聚糖和細胞分泌的外被多糖的 染色等。干細胞在誘導培養(yǎng)基的作用下，會逐漸 向軟骨細胞方向分化。軟骨細胞外具有一層富含 蛋白多糖的基質，是成軟骨分化的標志物，可被 阿利辛藍染成藍綠色。

 成軟骨誘導分化操作（平面誘導） 

1. 細胞分化誘導 

將對數生長期的細胞消化下來計數，成軟骨 誘導分化培養(yǎng)基誘導液重懸細胞，離心后調整細 胞密度密度1.0~2.0×10e7cells/mL。 吸取20 μL細胞懸液（約2.0~4.0×10e5個細胞） 懸滴至24孔板。置于37℃，5% CO2培養(yǎng)環(huán)境 下培養(yǎng)2~3 h使細胞貼壁。 2~3 h后補充1 mL成軟骨誘導分化培養(yǎng)基誘 導液正常培養(yǎng)。每隔2~3天換液一次。按照以上 換液頻率誘導21~28天，并注意觀察細胞形態(tài)變 化。 

2. 染色鑒定 

2.1 細胞固定 吸去培養(yǎng)基使用適量 1×PBS 清洗一次，棄去 后取適量 4%中性覆蓋培養(yǎng)器皿底面，室 溫固定 30~60 min 后，棄去固定液再使用 1×PBS 清洗兩次。

 2.2 阿利辛藍染色 向清洗干凈的誘導孔內加入適量染色液，避 光靜置染色 30 min。 吸去阿利辛藍染色液，用 1×PBS 清洗兩次， 并加入適量 1×PBS 避免細胞干燥。

 2.3 誘導評估 顯微鏡下觀察成軟骨染色效果，并進行圖像 采集和誘導評估。誘導成功時，軟骨組織中的內 酸性粘多糖可被阿利辛藍染成藍綠色。

 1. 干細胞的準備 

將對數生長期的細胞消化下來計數，取 3×10e5 個細胞轉移到 15 mL 離心管中，250 g 離 心 4 min。 棄上清，加入 0.5 mL 成軟骨誘導分化培養(yǎng)基 預混液，重懸細胞，150 g 離心 5 min。小心棄去 上清，加入 0.5 mL 成軟骨誘導分化培養(yǎng)基誘導 液，重懸細胞，150 g 離心 5 min。 將 15 mL 離心管的管蓋稍稍旋開，放置于 37℃，5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)。

 2. 細胞分化誘導 

24 h 后觀察細胞沉淀形變團聚的情況，如有 明顯的變化，則小心輕柔地撥動管底，嘗試讓細 胞團脫離管底，全部浸潤在誘導液中。 置于 37℃，5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)約 21 天， 通常每 2 天更換一次新鮮配制的成軟骨誘導分化 培養(yǎng)基誘導液。注意觀察細胞團成球情況及表面 光滑度，決定終止細胞誘導的時間，并進行染色 鑒定。

 3. 染色鑒定 

3.1 軟骨球固定 將軟骨球從離心管中轉移至 EP 管，并使用 1 ×PBS 清洗兩次，最后置于適量的 4%中性中。

 3.2 石蠟包埋切片 軟骨球經石蠟包埋后切片。 

3.3 阿利辛藍染色 將石蠟切片脫蠟和脫水，使用阿利辛藍染色 液染色 30 min，用自來水沖洗 2 min，蒸餾水沖 洗 1 次。 

3.4 誘導評估 顯微鏡下觀察成軟骨染色效果，并進行圖像 采集和誘導評估。誘導成功時，軟骨組織中的內 酸性粘多糖可被阿利辛藍染成藍綠色。 

NOTE: 干細胞的成軟骨分化水平因細胞類型、細胞供體 來源，培養(yǎng)條件、細胞代次、細胞狀態(tài)和分化時間等因素而異。