（貨號：WLRN5002）

原理概述：

本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴增技術(shù)：在常溫恒溫下，特殊修飾的反轉(zhuǎn)錄酶利用特異性引物和模板RNA合成cDNA鏈，反應(yīng)體系中的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和DNA聚合酶以新合成的cDNA鏈為模板進行快速核酸擴增反應(yīng)。依賴nfo酶的作用，加入根據(jù)模板設(shè)計的特異的分子探針，使用膠體金技術(shù)（三明治夾心法）可以對最終結(jié)果進行檢測。

引物設(shè)計：

建議使用長度在 30-35 bp的引物，引物過短會影響擴增速度和檢測靈敏度；下游引物的5’端標記一個修飾基團（常用）。引物設(shè)計避免形成二級結(jié)構(gòu)而影響擴增；擴增子長度建議在150-300 bp，通常不超過500 bp。

探針設(shè)計：

探針序列不與特異性引物識別位點重疊，長度為46-52 nt，序列避免回文序列、內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)和連續(xù)的重復堿基。探針共有三個修飾位點：5’端修飾一個抗原標記（典型FAM）;在5’端和3’末端的中部位置標記一個dSpacer（*，THF），作為nfo的識別位點；3’末端標記一個修飾基團，例如胺基、磷酸基團或C3-Spacer等。

試劑盒組成：

100T/盒

試劑盒儲存：

運輸條件：低溫運輸；

儲存條件：儲存溫度 ≤ -20 oC，避光保存，避免重壓、反復凍融；

產(chǎn)品有效期：6個月

操作步驟：提前將試劑盒所需組分取出，冰上或低溫下融化（C buffer可室溫融化），震蕩混勻。

1) 向無菌0.2mL PCR管中加入20 μL C buffer、5 μL L buffer；

2) 加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探針，再加入1.5μL dNTPs(10 mM)；

3) 向反應(yīng)管中加入12 μL PR-core和0.6 μL N-core，（步驟1~3可以混合后再分裝至反應(yīng)管中）；

4) 向反應(yīng)管中加入3.8 μL核酸模板；

5) 最后向反應(yīng)管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（請務(wù)必上下顛倒甩動反應(yīng)管8-10次進行混勻；對于多個反應(yīng)，建議提前將B buffer加至反應(yīng)管的蓋子內(nèi)側(cè)，蓋上蓋后上下顛倒后混勻）；混勻后，將反應(yīng)液甩（或快速離心）至管子底部，然后立即將反應(yīng)管放入恒溫設(shè)備中42 oC孵育8-12 min；

6) 反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL加入含有190 μL ddH₂O的離心管中，混合均勻后，將膠體金試紙條的樣品端插入離心管中平衡，5 min內(nèi)觀察質(zhì)控線與檢測線判讀結(jié)果。

體系配制

注意事項：

• 為保證液體試劑組分活性，請保證儲存溫度 ≤ -20 oC；試劑使用時請保持低溫，避免高溫放置過長時間；
• 在進行反應(yīng)時請注意避免微量核酸染，并設(shè)置空白對照實驗組。