（貨號：WLRN8209KIT）

原理概述：

本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴增技術(shù)：在常溫恒溫下，特殊修飾的反轉(zhuǎn)錄酶利用特異性引物和模板RNA合成cDNA鏈，反應(yīng)體系中的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和DNA聚合酶以新合成的cDNA鏈為模板進行快速核酸擴增反應(yīng)。依賴nfo酶的作用，加入根據(jù)模版設(shè)計的特異的分子探針，使用膠體金技術(shù)（三明治夾心法）可以對最終結(jié)果進行檢測。

產(chǎn)品特點：

本試劑盒具有靈敏度高、特異性強、反應(yīng)時間短（僅需12 mins）等優(yōu)點，反應(yīng)組分為干粉狀態(tài)，操作簡便，易于保存。

本試劑對設(shè)備要求低，金屬浴、水浴鍋等即可進行反應(yīng)操作，無需購買PCR擴增儀等價格高昂的專屬設(shè)備。

引物設(shè)計：

建議使用長度在 30-35 bp的引物，引物過短會影響擴增速度和檢測靈敏度；下游引物的5’端標(biāo)記一個修飾基團（常用）。引物設(shè)計避免形成二級結(jié)構(gòu)而影響擴增；擴增子長度建議在150-300 bp。

熒光探針設(shè)計：

在上下游引物中間，設(shè)計一段長度為46-52nt與目的片段互補的序列；5’端修飾一個抗原標(biāo)記（典型FAM）; 在5’端和3’末端的中部位置標(biāo)記一個dSpacer（*，THF），作為nfo的識別位點；3’末端標(biāo)記一個修飾基團，例如胺基、磷酸基團或C3-Spacer等。

試劑盒組成：

試劑盒儲存：

運輸條件：低溫運輸；

儲存條件：建議儲存溫度 ≤ -20 oC，避光保存，避免重壓和反復(fù)凍融；

產(chǎn)品有效期：14個月。

操作步驟：提前30分鐘將試劑盒所需組分取出，室溫融化，震蕩混勻。

1) 每個干粉反應(yīng)管加入29.4 μL A buffer（注意：A buffer需融化混勻，否則會對實驗效果產(chǎn)生影響）；

2) 每個反應(yīng)管分別加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探針（引物和探針濃度為10 μM，對于多個反應(yīng)、步驟1和步驟2可以混合后再分裝至反應(yīng)管中）；

3) 向反應(yīng)管中依次加入11.5 μL ddH₂O和2 μL核酸模板（可根據(jù)核酸濃度調(diào)整加入的核酸模板體積，并相應(yīng)調(diào)整加入的ddH₂O體積，至模板與ddH₂O總體積為13.5 μL）；

4) 最后向反應(yīng)管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（請務(wù)必上下顛倒甩動反應(yīng)管8-10次進行混勻；對于多個反應(yīng)，建議將B buffer加至反應(yīng)管的蓋子內(nèi)側(cè)上下顛倒后混勻）；

5) 混勻后，將反應(yīng)液甩（或快速離心）至管子底部，然后立即將反應(yīng)管放入恒溫設(shè)備中42 oC孵育8-12 mins；

6) 反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL加入含有190 μL ddH₂O的離心管中，混合均勻后，將膠體金試紙條的樣品端插入離心管中平衡，5 mins內(nèi)觀察質(zhì)控線與檢測線判讀結(jié)果。

體系配制

注意事項：

1． 由于試劑盒靈敏度非常高，在進行反應(yīng)時請注意避免核酸污染，并設(shè)置空白對照；

2． 使用時請取出實驗所需的MIRA反應(yīng)單元的數(shù)量，剩余部分請置于存儲條件下。