細(xì)胞簡(jiǎn)介：

人軟骨分離自軟骨組織；軟骨組織由軟骨細(xì)胞、基質(zhì)及纖維構(gòu)成。軟骨組織再生能力強(qiáng)，這些增生的幼稚細(xì)胞形似纖維母細(xì)胞，以后逐漸變?yōu)檐浌悄讣?xì)胞，并形成軟骨基質(zhì)，細(xì)胞被埋在軟骨陷窩內(nèi)而變?yōu)殪o止的軟骨細(xì)胞。根據(jù)軟骨組織內(nèi)所含纖維成分的不同，可將軟骨分為透明軟骨、彈性軟骨和纖維軟骨三種，其中以透明軟骨的分布較廣，結(jié)構(gòu)也較典型。軟骨細(xì)胞（chondrocyte）位于軟骨陷窩內(nèi)。幼稚的軟骨細(xì)胞位于軟骨組織的表層，單個(gè)分布，體積較小，呈橢圓形，長(zhǎng)軸與軟骨表面平行，越向深層的軟骨細(xì)胞體積之間增大呈圓形，細(xì)胞核圓形或卵圓形，染色淺，細(xì)胞質(zhì)弱嗜堿性，常見(jiàn)數(shù)量不一的脂滴。成熟的軟骨細(xì)胞多2-8個(gè)成群分布于軟骨陷窩內(nèi)，這些軟骨細(xì)胞由同一個(gè)母細(xì)胞分裂增殖而成，稱為同源細(xì)胞群。電鏡下，軟骨細(xì)胞有突起和皺褶，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和發(fā)達(dá)的高爾基復(fù)合體及少量的線粒體。在組織切片中，軟骨細(xì)胞收縮為不規(guī)則形，在軟骨囊和細(xì)胞之間出現(xiàn)較大的腔隙。體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞對(duì)于研究其生理功能、藥物作用以及各種致病因素作用下的病理生理改變具重要意義。
方法簡(jiǎn)介：

公司實(shí)驗(yàn)室分離的人軟骨采用膠原酶-中性dan白酶聯(lián)合消化制備而來(lái)，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。
質(zhì)量檢測(cè)：

公司實(shí)驗(yàn)室分離的人軟骨經(jīng)Ⅱ型膠原蛋白免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

1) 將5-10d的乳鼠浸泡入75%乙醇中，移入生物安全柜，

2) 從胸部解剖乳鼠，取出雙肺置于預(yù)冷的PBS中，盡可能的除去結(jié)締組織等，

3) 取肺邊緣部分，剪碎，將組織塊移入T25培養(yǎng)瓶中，倒置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，

4) 2h后，培養(yǎng)瓶中注入2 mL內(nèi)皮培養(yǎng)基，小心將培養(yǎng)瓶正置于培養(yǎng)箱，確保組織塊不會(huì)飄起來(lái)，

5) 每3d換液2mL，待細(xì)胞從組織塊中爬出來(lái)后，隔2d換液，待細(xì)胞融合達(dá)到60-70%左右時(shí)，去除組織塊，將肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞重新鋪瓶。

1、您收到細(xì)胞后，請(qǐng)按照以下方法進(jìn)行操作：

取出T-25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置4-6小時(shí)或過(guò)夜，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)，然后換用新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)或進(jìn)行傳代。

2、細(xì)胞傳代：

1）細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2）添加0.125%消化液約2ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后加入培養(yǎng)液終止消化，再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1500rpm/min，離心5min；

3）棄上清，沉淀細(xì)胞用12ml培養(yǎng)基重懸，然后按1:2比例進(jìn)行分瓶傳代，放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4）待細(xì)胞貼壁后，觀察培養(yǎng)結(jié)果，之后進(jìn)行換液培養(yǎng)或傳代。

3、細(xì)胞凍存：

1）細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2）添加0.125%消化液約2ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，再加入培養(yǎng)液終止消化，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1500rpm/min，離心5min；

3）用適當(dāng)量的凍存液（基礎(chǔ)培養(yǎng)基：FBS：DMSO=7:2:1）重懸細(xì)胞，并放置于凍存管中；

4）先將細(xì)胞凍存管放置于-20℃ 1.5h，然后將其移入-80℃過(guò)夜，24h后轉(zhuǎn)入液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期保存。

4、細(xì)胞復(fù)蘇：

1）從液氮中取出細(xì)胞凍存管（注意：佩戴防爆管面具）， 快速將其置入37℃水浴中解凍，直至凍存管中無(wú)結(jié)晶，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；

2）將凍存管中的細(xì)胞移至15ml無(wú)菌離心管中，滴加入培養(yǎng)液5ml混勻細(xì)胞，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至適當(dāng)面積大小的培養(yǎng)皿中；

3）放置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4）第二天，換用新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。