細胞簡介：

人NK分離自人外周血單個核細胞；NK細胞即自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）是機體重要的免疫細胞，不僅與抗腫瘤、 抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，而且在某些情況下參與超敏反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)生，能夠識別靶細胞、殺傷介質(zhì)。NK細胞來源于骨髓淋巴樣干細胞，其分化、發(fā)育依賴于骨髓及胸腺微環(huán)境，主要分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴結(jié)。NK細胞不同于T、B細胞，是一類無需預(yù)先致敏就能非特異性殺傷腫瘤細胞和病毒感染細胞的淋巴細胞。由于NK細胞的殺傷活性無MHC限制，不依賴抗體，因此稱為自然殺傷活性。NK細胞胞漿豐富，含有較大的嗜天青顆粒，顆粒的含量與NK細胞的殺傷活性呈正相關(guān)。NK細胞作用于靶細胞后殺傷作用出現(xiàn)早，在體外1小時、體內(nèi)4小時即可見到殺傷效應(yīng)。NK細胞的靶細胞主要有某些腫瘤細胞（包括部分細胞系）、病毒感染細胞、某些自身組織細胞（如血細胞）、寄生蟲等，因此NK細胞是機體抗腫瘤、抗感染的重要免疫因素，也參與第Ⅱ型超敏反應(yīng)和移植物抗宿主反應(yīng)。
方法簡介：

公司實驗室分離的人外周血NK采用取外周血、通過密度梯度離心、差速貼壁、細胞因子誘導法制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。
質(zhì)量檢測：

公司實驗室分離的人源NK經(jīng)CD56免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

1) 將5-10d的乳鼠浸泡入75%乙醇中，移入生物安全柜，

2) 從胸部解剖乳鼠，取出雙肺置于預(yù)冷的PBS中，盡可能的除去結(jié)締組織等，

3) 取肺邊緣部分，剪碎，將組織塊移入T25培養(yǎng)瓶中，倒置于細胞培養(yǎng)箱中，

4) 2h后，培養(yǎng)瓶中注入2 mL內(nèi)皮培養(yǎng)基，小心將培養(yǎng)瓶正置于培養(yǎng)箱，確保組織塊不會飄起來，

5) 每3d換液2mL，待細胞從組織塊中爬出來后，隔2d換液，待細胞融合達到60-70%左右時，去除組織塊，將肺微血管內(nèi)皮細胞重新鋪瓶。

1、您收到細胞后，請按照以下方法進行操作：

取出T-25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中靜置4-6小時或過夜，以穩(wěn)定細胞狀態(tài)，然后換用新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)或進行傳代。

2、細胞傳代：

1）細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞一次；

2）添加0.125%消化液約2ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后加入培養(yǎng)液終止消化，再輕輕吹打細胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1500rpm/min，離心5min；

3）棄上清，沉淀細胞用12ml培養(yǎng)基重懸，然后按1:2比例進行分瓶傳代，放入37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4）待細胞貼壁后，觀察培養(yǎng)結(jié)果，之后進行換液培養(yǎng)或傳代。

3、細胞凍存：

1）細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞一次；

2）添加0.125%消化液約2ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后輕輕吹打細胞使之脫落，再加入培養(yǎng)液終止消化，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1500rpm/min，離心5min；

3）用適當量的凍存液（基礎(chǔ)培養(yǎng)基：FBS：DMSO=7:2:1）重懸細胞，并放置于凍存管中；

4）先將細胞凍存管放置于-20℃ 1.5h，然后將其移入-80℃過夜，24h后轉(zhuǎn)入液氮中進行長期保存。

4、細胞復蘇：

1）從液氮中取出細胞凍存管（注意：佩戴防爆管面具）， 快速將其置入37℃水浴中解凍，直至凍存管中無結(jié)晶，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；

2）將凍存管中的細胞移至15ml無菌離心管中，滴加入培養(yǎng)液5ml混勻細胞，然后將細胞懸液轉(zhuǎn)移至適當面積大小的培養(yǎng)皿中；

3）放置于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4）第二天，換用新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。