細(xì)胞簡介：

小鼠真皮毛乳頭分離自皮膚毛囊組織；毛囊是表皮細(xì)胞連續(xù)形成的袋樣上皮。其基底是真皮凹進(jìn)的真皮毛乳頭，中心是一根毛發(fā)，立毛肌的一側(cè)斜附在毛囊壁上，附著點的上方為皮脂腺通入毛囊的短頸，毛囊在皮膚表面的開口是毛囊孔。毛囊位于真皮和皮下組織中，毛囊向下伸入真皮約有一厘米深度，它是由包繞毛發(fā)與表皮相連的上皮鞘，以及皮脂腺和立毛肌所組成的一個結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的器官附件組織。毛囊實際上是由結(jié)締組織和上皮兩部分所組成，除了具有結(jié)締組織和血管的真皮乳頭（毛乳頭）外，毛囊其余部分都是由表皮細(xì)胞分化而來。真皮毛乳頭細(xì)胞位于毛囊基底部，是一類成纖維細(xì)胞。在毛囊發(fā)育早期，真皮細(xì)胞向單層上皮細(xì)胞發(fā)出真皮信號，刺激上皮局部形成毛基板。隨后毛基板細(xì)胞向下方的真皮發(fā)出表皮信號，誘導(dǎo)其形成有成纖維細(xì)胞組成的凝集細(xì)胞團。在此過程中，毛母質(zhì)細(xì)胞逐漸包裹凝集細(xì)胞團，形成成熟的真皮毛乳頭細(xì)胞。作為毛囊中的重要細(xì)胞群，真皮毛乳頭細(xì)胞的分子機制和臨床應(yīng)用正在被逐漸認(rèn)識和解析。
方法簡介：

公司實驗室分離的小鼠真皮毛乳頭采用膠原酶-中性dan白酶混合消化法制備而來，細(xì)胞總量約為5×105cells/瓶。
質(zhì)量檢測：

公司實驗室分離的小鼠真皮毛乳頭經(jīng)層粘連蛋白免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

1) 將5-10d的乳鼠浸泡入75%乙醇中，移入生物安全柜，

2) 從胸部解剖乳鼠，取出雙肺置于預(yù)冷的PBS中，盡可能的除去結(jié)締組織等，

3) 取肺邊緣部分，剪碎，將組織塊移入T25培養(yǎng)瓶中，倒置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，

4) 2h后，培養(yǎng)瓶中注入2 mL內(nèi)皮培養(yǎng)基，小心將培養(yǎng)瓶正置于培養(yǎng)箱，確保組織塊不會飄起來，

5) 每3d換液2mL，待細(xì)胞從組織塊中爬出來后，隔2d換液，待細(xì)胞融合達(dá)到60-70%左右時，去除組織塊，將肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞重新鋪瓶。

1、您收到細(xì)胞后，請按照以下方法進(jìn)行操作：

取出T-25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置4-6小時或過夜，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)，然后換用新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)或進(jìn)行傳代。

2、細(xì)胞傳代：

1）細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2）添加0.125%消化液約2ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后加入培養(yǎng)液終止消化，再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1500rpm/min，離心5min；

3）棄上清，沉淀細(xì)胞用12ml培養(yǎng)基重懸，然后按1:2比例進(jìn)行分瓶傳代，放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4）待細(xì)胞貼壁后，觀察培養(yǎng)結(jié)果，之后進(jìn)行換液培養(yǎng)或傳代。

3、細(xì)胞凍存：

1）細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2）添加0.125%消化液約2ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，再加入培養(yǎng)液終止消化，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1500rpm/min，離心5min；

3）用適當(dāng)量的凍存液（基礎(chǔ)培養(yǎng)基：FBS：DMSO=7:2:1）重懸細(xì)胞，并放置于凍存管中；

4）先將細(xì)胞凍存管放置于-20℃ 1.5h，然后將其移入-80℃過夜，24h后轉(zhuǎn)入液氮中進(jìn)行長期保存。

4、細(xì)胞復(fù)蘇：

1）從液氮中取出細(xì)胞凍存管（注意：佩戴防爆管面具）， 快速將其置入37℃水浴中解凍，直至凍存管中無結(jié)晶，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；

2）將凍存管中的細(xì)胞移至15ml無菌離心管中，滴加入培養(yǎng)液5ml混勻細(xì)胞，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至適當(dāng)面積大小的培養(yǎng)皿中；

3）放置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4）第二天，換用新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。