【儀表網(wǎng) 研發(fā)快訊】近期，中國科學(xué)院長(zhǎng)春光機(jī)所在Light: Science & Applications發(fā)表了題為“Time-resolved photon counting Fourier-transform micro-spectroscopy enables simultaneous Raman and fluorescence lifetime imaging”的研究論文。本文第一作者為尚林東博士，通訊作者為李備研究員、Wolfgang Langbein教授。團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新性地開發(fā)了時(shí)間分辨光子計(jì)數(shù)傅里葉變換顯微拉曼光譜平臺(tái)。該技術(shù)巧妙融合了光子計(jì)數(shù)的高靈敏度和傅里葉變換光譜的寬譜高分辨優(yōu)勢(shì)，成功拓寬了可探測(cè)的光譜范圍并提升了光譜分辨能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果有力證實(shí)，該儀器不僅能高效分離拉曼與熒光信號(hào)，更能同步實(shí)現(xiàn)高空間分辨率的拉曼與熒光壽命成像。
 

　　拉曼光譜是材料科學(xué)、半導(dǎo)體工業(yè)、環(huán)境測(cè)試、考古學(xué)和生物醫(yī)學(xué)的重要工具。一個(gè)重要的限制是熒光背景，它可能會(huì)淹沒拉曼光譜信號(hào)。大多數(shù)拉曼光譜使用連續(xù)激光器激發(fā)信號(hào)，因此無法根據(jù)拉曼和熒光成分的時(shí)間動(dòng)力學(xué)來分離拉曼和熒光成分(拉曼信號(hào)是瞬時(shí)的，熒光的典型壽命在納秒范圍內(nèi))。通常的做法是從測(cè)量的拉曼光譜中擬合光譜中的熒光寬背景，以消除熒光。然而這種做法會(huì)將部分拉曼信號(hào)一并扣除，會(huì)影響拉曼光譜的分析識(shí)別。為了真正實(shí)現(xiàn)熒光抑制這一問題，需要使用時(shí)間門控拉曼技術(shù)。目前，光柵式時(shí)間門控技術(shù)已有成功案例，但由于單光子雪崩二極管(SPAD)技術(shù)瓶頸，難以同時(shí)滿足高光譜分辨率、寬光譜范圍和高時(shí)間分辨率的需求。
 

　　本文提出了一種基于高分辨率傅里葉變換光譜儀和SPAD的時(shí)間門控拉曼系統(tǒng)。研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一個(gè)光子矩陣來存儲(chǔ)SPAD檢測(cè)到的光子事件，并開發(fā)了一種策略來校正所獲得的光子矩陣干涉曲線，以獲得高信噪比的時(shí)間分辨拉曼光譜。
 

圖1 傅里葉時(shí)間門控拉曼光譜儀光路圖
 

　　研究團(tuán)隊(duì)采用馬赫曾德爾干涉儀結(jié)合高精度直線電機(jī)位移臺(tái)，并與單光子雪崩二極管、單光子計(jì)數(shù)器時(shí)間標(biāo)記采集配合使用(圖1)，允許將光子事件按照發(fā)生絕對(duì)時(shí)間和相對(duì)時(shí)間順序放置在光子矩陣中(圖2a，b)。該矩陣橫軸疊加為干涉強(qiáng)度曲線，縱軸疊加為熒光壽命曲線(圖2c)。
 

圖2 記錄光子數(shù)據(jù)得到光子矩陣。
 

　　在傅里葉式干涉系統(tǒng)中，位移臺(tái)的校準(zhǔn)一直是一個(gè)核心問題，由于本工作使用波長(zhǎng)532nm的脈沖激光，相比傳統(tǒng)傅立葉式使用1064nm激光對(duì)位移臺(tái)校正精度要求更高，再加上本工作使用四倍光程差設(shè)計(jì)，使位移臺(tái)的移動(dòng)錯(cuò)誤放大了四倍，所以校正難度進(jìn)一步增大。為了解決這些問題，本工作使用位置同步輸出(PSO)結(jié)合單模激光干涉相位擬合的方式對(duì)位移臺(tái)進(jìn)行位置校正。從結(jié)果圖中可以看出經(jīng)過位置校正后激光譜線信噪比有了極大提升(圖3)。
 

圖3 高精度位移臺(tái)校正過程圖。
 

　　為了確定系統(tǒng)整體時(shí)間分辨率和光譜分辨率，研究團(tuán)隊(duì)首先使用脈沖激光測(cè)試其時(shí)間分辨率。從脈沖激光譜線2D、3D熱圖(圖4a，c)中可以看出該儀器實(shí)現(xiàn)了547 ps的時(shí)間分辨率(圖4b)。其次使用連續(xù)激光測(cè)試系統(tǒng)最大光譜分辨率，從圖中可以看到系統(tǒng)最大可實(shí)現(xiàn)的光譜分辨率為0.05 cm-1(圖4d，e)。
 

圖4 系統(tǒng)時(shí)間分辨率和最大光譜分辨率結(jié)果圖。
 

　　為了驗(yàn)證系統(tǒng)的拉曼熒光信號(hào)分離能力。團(tuán)隊(duì)使用在表面涂覆熒光材料的硅片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(R6G-PVA-Si)。圖5a為樣品掃描結(jié)果熱圖(時(shí)間延遲 -1000-50000ps.光譜范圍為-500-10000cm-1)。將熱圖按照時(shí)間延遲進(jìn)行區(qū)域劃分可以設(shè)置為拉曼區(qū)域，拉曼熒光混合區(qū)域，熒光區(qū)域。圖5b為不同區(qū)域的光譜均譜?？梢钥吹皆诶鼌^(qū)域有明顯的硅峰信號(hào)，而隨著時(shí)間延遲增大，熒光信號(hào)開始顯現(xiàn)，直到無法看到硅峰信號(hào)。結(jié)果證明了系統(tǒng)的拉曼熒光分離能力。
 

圖5 R6G-PVA-Si 樣本拉曼熒光分離結(jié)果圖。
 

　　為了進(jìn)一步驗(yàn)證系統(tǒng)的時(shí)間門控拉曼2D掃描能力，團(tuán)隊(duì)使用熒光小球進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，我們?nèi)詫⑷珪r(shí)間延遲分為拉曼、拉曼熒光混合、熒光三大部分，從圖中可以清晰看到在拉曼延遲范圍內(nèi)，能夠獲得清晰的小球拉曼信號(hào)和2D掃描圖像。隨著時(shí)間延遲增加，在混合區(qū)域內(nèi)開始出現(xiàn)明顯的熒光信號(hào)。再隨著時(shí)間延遲增加，2D熱圖中就無法觀測(cè)到小球的拉曼信號(hào)了(圖6)。結(jié)果證實(shí)，該儀器能夠有效地分離拉曼信號(hào)和熒光信號(hào)。
 

　　圖6：用 5μm PMMA 和 2μm PS 塑料微球用 R6G染色后測(cè)試結(jié)果圖。
 

　　本研究提出傅里葉式光子計(jì)數(shù)時(shí)間門控拉曼光譜技術(shù)，巧妙地融合光子計(jì)數(shù)的高靈敏度與傅里葉變換光譜的寬譜高分辨優(yōu)勢(shì)，成功突破了傳統(tǒng)時(shí)間門控拉曼光譜在光譜范圍窄和分辨率低方面的核心限制。研究團(tuán)隊(duì)通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)驗(yàn)證，證實(shí)了該平臺(tái)能夠高效分離拉曼與熒光信號(hào)，并在單次測(cè)量中實(shí)現(xiàn)兩種成像模態(tài)的精準(zhǔn)同步，解決了長(zhǎng)期以來難以兼顧光譜信息與熒光壽命信息的難題。這一突破性設(shè)計(jì)有望成為拉曼熒光抑制的關(guān)鍵技術(shù)，在化學(xué)、生物學(xué)、材料科學(xué)、藥物檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域展現(xiàn)廣闊的應(yīng)用前景。