【中文題目】 在早期腦發(fā)育中ADAR3通過(guò)調(diào)控mRNA穩(wěn)定性與翻譯，抑制神經(jīng)元分化

【文章題目】ADAR3 modulates neuronal differentiation and regulates mRNA stability and translation

【發(fā)表期刊】Nucleic Acids Research（Q1，IF 13.1）

【發(fā)表年份】2024年9月

【研究團(tuán)隊(duì)】瑞典斯德哥爾摩大學(xué)Wenner-Gren研究所分子生物科學(xué)系Neus Visa教授團(tuán)隊(duì)

【核心技術(shù)】多核糖體圖譜分析（Polysome profiling）、RNA免疫共沉淀(RIP)、免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析（Co-IP/MS）、嘌呤霉素標(biāo)記檢測(cè)、鄰位連接技術(shù)（PLA）等

【研究概要】ADAR3是RNA腺苷脫氨酶家族中一個(gè)無(wú)催化活性的成員，本研究探討了其在小鼠大腦發(fā)育中的功能。ADAR3的表達(dá)水平在胚胎發(fā)生過(guò)程中逐漸升高，而在出生后則下降。利用原代皮層神經(jīng)元，作者發(fā)現(xiàn)在體外分化的神經(jīng)元中，只有一部分亞群表達(dá)ADAR3，這表明ADAR3在大腦中并非充當(dāng)ADAR編輯的通用調(diào)節(jié)因子，而是具有特定功能。ADAR3相互作用組的分析提示，其在mRNA穩(wěn)定性和翻譯過(guò)程中發(fā)揮作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在原本不表達(dá)ADAR3的神經(jīng)元細(xì)胞系中表達(dá)ADAR3，會(huì)改變大量mRNA的表達(dá)水平與穩(wěn)定性。此外，發(fā)現(xiàn)ADAR3 能夠與多聚核糖體結(jié)合，并抑制翻譯過(guò)程。于是推測(cè)ADAR3 結(jié)合目標(biāo)mRNA，并使其穩(wěn)定在多聚核糖體復(fù)合物中阻礙其翻譯延伸。有趣的是，ADAR3的表達(dá)會(huì)下調(diào)與神經(jīng)元分化相關(guān)的基因，并在體外抑制神經(jīng)圖生長(zhǎng)。綜上所述，ADAR3以不依賴于RNA編輯的方式調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性和翻譯，從而對(duì)神經(jīng)元分化發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。

研究背景

RNA編輯對(duì)于維持正常的神經(jīng)元活動(dòng)至關(guān)重要。多項(xiàng)研究表明，RNA編輯和ADAR酶的缺陷，與多種癌癥和神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，如：阿爾茨海默病、癡呆、Aicardi-Goutières綜合征和遺傳性對(duì)稱性色素異常癥。

ADAR家族成員包含ADAR1、ADAR2、ADAR3，主要作用是催化RNA中腺苷（A）→（I）的編輯（即：A-to-I編輯），能夠影響RNA穩(wěn)定性、翻譯及轉(zhuǎn)錄組多樣性。所有ADAR蛋白的C端均具有一個(gè)脫氨酶結(jié)構(gòu)域，以及用于輔助底物識(shí)別的雙鏈RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（dsRBD）。此外，ADAR1還具有Z-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，而ADAR3則含有一個(gè)富含Arg的R結(jié)合結(jié)構(gòu)域，推測(cè)該結(jié)構(gòu)域能與單鏈RNA結(jié)合。ADAR3與ADAR2高度相似。但由于其脫氨結(jié)構(gòu)域及催化核心的關(guān)鍵氨基酸發(fā)生了替換，因此ADAR3不具備催化活性。與在多種組織中廣泛表達(dá)的ADAR1和ADAR2不同，ADAR3的表達(dá)局限于大腦。然而，對(duì)ADAR3在神經(jīng)元中的功能及其分子調(diào)控機(jī)制還不清楚。

研究結(jié)果

1.  ADAR3 在小鼠腦中的表達(dá)與定位具有發(fā)育調(diào)控特征

研究人員檢測(cè)了ADAR3在小鼠腦發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)變化，結(jié)果顯示其mRNA和蛋白水平從胚胎期12.5天開(kāi)始可檢測(cè)到，在胚胎期18天達(dá)到高峰，出生后迅速下降。在體外培養(yǎng)的小鼠皮層神經(jīng)元中進(jìn)行細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，ADAR3在分化早期（DIV2-4）廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核；從DIV6開(kāi)始，ADAR3逐漸局限于少數(shù)細(xì)胞，并集中于核仁中。隨著神經(jīng)元分化，ADAR3僅在特定亞群中持續(xù)表達(dá)，提示其功能具有細(xì)胞類型特異性，而非全局調(diào)控的RNA編輯?？傊珹DAR3的表達(dá)和定位在腦發(fā)育過(guò)程中受到嚴(yán)格調(diào)控，暗示其在神經(jīng)元分化中發(fā)揮特定作用。

圖1.在小鼠腦發(fā)育中ADAR3的表達(dá)水平

2. ADAR3表達(dá)可以改變mRNA水平，但不是通過(guò)RNA編輯調(diào)控

為研究ADAR3功能，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)ADAR3的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系（N2A-A3），并與對(duì)照組（N2A-C）進(jìn)行比較。轉(zhuǎn)錄組分析共鑒定到98個(gè)差異表達(dá)基因（33 個(gè)上調(diào)，65 個(gè)下調(diào)）。其中，上調(diào)基因主要與細(xì)胞黏附、組織早期發(fā)育相關(guān)；下調(diào)基因主要富集于突觸功能、鈣離子調(diào)控的分泌等神經(jīng)相關(guān)通路。RNA編輯分析發(fā)現(xiàn)，雖然檢測(cè)到大量 A-to-I 編輯位點(diǎn)，但差異表達(dá)的mRNA中幾乎不包含差異編輯位點(diǎn)，這說(shuō)明ADAR3可調(diào)控神經(jīng)相關(guān)基因表達(dá)，但這種調(diào)控不是通過(guò)RNA編輯活性實(shí)現(xiàn)的。

圖2. N2A-A3神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組表征

3. ADAR3影響mRNA穩(wěn)定性，尤其與神經(jīng)分化和干細(xì)胞維持相關(guān)

研究人員使用triptolide抑制新轉(zhuǎn)錄物合成，然后通過(guò)Poly-A RNA-seq評(píng)估m(xù)RNA的降解速率，發(fā)現(xiàn)ADAR3使1020個(gè)轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性增加，474個(gè)穩(wěn)定性下降。其中，穩(wěn)定性下降的mRNA主要富集于細(xì)胞命運(yùn)決定、細(xì)胞命運(yùn)特化等與分化相關(guān)的通路；而穩(wěn)定性上升的mRNA主要富集于核糖體生物合成、RNA加工等基礎(chǔ)細(xì)胞過(guò)程。交聯(lián)RNA免疫沉淀和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證明，ADAR3可直接結(jié)合多個(gè)受其調(diào)控的mRNA，提示其作用是直接的。因此，ADAR3通過(guò)直接結(jié)合并調(diào)控mRNA穩(wěn)定性，抑制分化相關(guān)基因的表達(dá)，維持細(xì)胞處于未分化狀態(tài)。這種效果至少部分是由于ADAR3-mRNA直接結(jié)合促使其穩(wěn)定性增強(qiáng)的。

圖3. ADAR3表達(dá)影響mRNA穩(wěn)定性

4. ADAR3的相互作用組揭示其與mRNA穩(wěn)定、翻譯和核糖體生成密切相關(guān)

通過(guò)Co-IP/MS分析研究人員鑒定了ADAR3的相互作用蛋白，其中包括多個(gè)核糖體蛋白及調(diào)控mRNA穩(wěn)定性的蛋白。互作蛋白主要富集于mRNA穩(wěn)定性、翻譯、核糖體生物合成通路中。PLA結(jié)果顯示，ADAR3與這些蛋白的相互作用主要發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中。RNase處理實(shí)驗(yàn)表明，部分相互作用不依賴RNA，提示ADAR3可直接與蛋白結(jié)合。因此，ADAR3定位于細(xì)胞質(zhì)中，與核糖體和翻譯相關(guān)蛋白密切結(jié)合，提示其可能直接參與翻譯調(diào)控。

圖4. ADAR3可與mRNA穩(wěn)定因子和核糖體蛋白直接結(jié)合，且定位于細(xì)胞質(zhì)中

5. ADAR3可抑制全局翻譯延伸

為驗(yàn)證ADAR3是否影響翻譯，研究人員進(jìn)行了多個(gè)功能性實(shí)驗(yàn)。嘌呤霉素?fù)饺雽?shí)驗(yàn)表明ADAR3表達(dá)的細(xì)胞中新生蛋白合成顯著減少。Polysome profiling結(jié)果表明ADAR3表達(dá)的細(xì)胞中多聚核糖體比例升高（polysomes），但翻譯效率下降（M/P）。通常，翻譯起始缺陷會(huì)導(dǎo)致M/P比值升高，但翻譯延伸和/或終止缺陷則可能導(dǎo)致M/P比值降低。結(jié)合以上嘌呤霉素?fù)饺雽?shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)ADAR3的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致翻譯延伸和/或終止過(guò)程出現(xiàn)缺陷。接下來(lái)，使用三尖杉酯堿（Harringtonine）處理細(xì)胞5分鐘（抑制翻譯起始），再進(jìn)行嘌呤霉素?fù)饺雽?shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADAR3表達(dá)的細(xì)胞中嘌呤霉素?fù)饺肓匡@著降低，這表明其翻譯延伸速度顯著減慢。Western blot結(jié)果顯示ADAR3確實(shí)存在于多聚核糖體組分中，且隨嘌呤霉素處理而解離。因此，ADAR3通過(guò)與多聚核糖體結(jié)合抑制翻譯延伸，從而降低全局蛋白質(zhì)合成速率。

圖5. ADAR3與多聚核糖體結(jié)合，抑制翻譯延伸

6. mRNA穩(wěn)定性與蛋白表達(dá)變化趨勢(shì)并不一致

盡管ADAR3增強(qiáng)了大量mRNA穩(wěn)定性，但蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，在180個(gè)被穩(wěn)定的mRNA 中，僅19個(gè)對(duì)應(yīng)的蛋白水平發(fā)生顯著變化，其中15個(gè)反而下降。推測(cè)ADAR3將mRNA“困"在翻譯效率低下的多聚核糖體中，使其穩(wěn)定但無(wú)法高效翻譯。因此得出結(jié)論，ADAR3對(duì)mRNA的穩(wěn)定作用并不必然導(dǎo)致蛋白表達(dá)上升，反而可能通過(guò)抑制翻譯形成“表達(dá)緩沖"機(jī)制。

7. ADAR3抑制神經(jīng)元分化與神經(jīng)突生長(zhǎng)

最后，研究人員在細(xì)胞分化模型中驗(yàn)證ADAR3的功能。RA誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)表明ADAR3表達(dá)的細(xì)胞在誘導(dǎo)后，神經(jīng)突長(zhǎng)度顯著短于對(duì)照細(xì)胞。誘導(dǎo)分化細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，對(duì)照細(xì)胞在誘導(dǎo)后出現(xiàn)大量與分化相關(guān)的蛋白變化，而ADAR3表達(dá)的細(xì)胞中這些變化被顯著抑制。其中，在N2A-A3細(xì)胞中下調(diào)的蛋白，包含APP、APBB1和SRGAP2，這些蛋白主要與神經(jīng)元活動(dòng)與神經(jīng)元分化相關(guān)。綜上所述，ADAR3顯著抑制RA誘導(dǎo)的神經(jīng)元分化，進(jìn)一步證實(shí)其在神經(jīng)元命運(yùn)決定中的負(fù)調(diào)控作用。

圖6. ADAR3抑制體外神經(jīng)元分化和神經(jīng)突生長(zhǎng)

本文小結(jié)

這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，ADAR3雖然不能編輯RNA，但在早期胚胎大腦發(fā)育種扮演了重要角色。ADAR3結(jié)合并穩(wěn)定特定mRNA以及抑制翻譯延伸，從而抑制神經(jīng)元分化關(guān)鍵基因的表達(dá)及神經(jīng)突生長(zhǎng)，進(jìn)而維持神經(jīng)前體細(xì)胞處于未分化狀態(tài)，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間窗口內(nèi)防止過(guò)早分化。該研究揭示了神經(jīng)元亞群特異性的調(diào)控機(jī)制，該機(jī)制對(duì)于早期腦發(fā)育可能至關(guān)重要。

參考文獻(xiàn)：Karlstr?m V, Sagredo EA, Planells J, Welinder C, Jungfleisch J, Barrera-Conde A, Engfors L, Daniel C, Gebauer F, Visa N, ?hman M. ADAR3 modulates neuronal differentiation and regulates mRNA stability and translation. Nucleic Acids Res. 2024 Oct 28;52(19):12021-12038.