高效液相色譜法（HPLC）是分析化學(xué)中廣泛使用的一種技術(shù)，用于分離、鑒定和量化混合物中的成分。高效液相色譜分離的成功與否在很大程度上取決于流動相的特性，流動相是流經(jīng)固定相的液體溶劑。應(yīng)根據(jù)分析物的化學(xué)性質(zhì)和所用固定相的性質(zhì)仔細(xì)選擇流動相。

定義：流動相是流經(jīng)高效液相色譜柱固定相的液體溶劑，攜帶著分析物。流動相有兩個主要作用：一是溶解樣品成分并將其帶入固定相；二是與固定相相互作用，促進(jìn)分析物的分離。

類型：高效液相色譜法使用的流動相可分為兩大類：水性流動相和非水性流動相。水性流動相的主要成分是水，而非水性流動相不含水。

水性流動相：高效液相色譜分離通常使用水性流動相，因為水性流動相能有效溶解多種分析物，而且價格通常低于非水性溶劑。見的水性流動相是水與甲醇或乙腈等有機試劑的混合物。有機改性劑的選擇取決于所分離分析物的性質(zhì)和所使用的固定相。

非水性流動相：當(dāng)被分離的分析物不溶于水或水會干擾分離時，就會使用非水性流動相。非水性流動相包括二氯甲烷、*和正己烷等溶劑。這些溶劑通常與甲醇或乙腈等極性溶劑結(jié)合使用，以提高分離效率。

流動相的特性：流動相的特性對高效液相色譜分離至關(guān)重要，因為它們會極大地影響分離效率和選擇性。流動相最重要的特性包括極性、粘度、pH 值和離子強度。

極性：流動相的極性是高效液相色譜分離的關(guān)鍵因素，因為它決定了分析物與固定相之間相互作用的強度。極性流動相適用于分離極性化合物，而非極性流動相則是分離非極性化合物的理想選擇。可以通過改變水性流動相中有機改性劑與水的比例來調(diào)節(jié)流動相的極性。

粘度：粘度是流動相的另一個關(guān)鍵屬性，因為它會影響流動相通過色譜柱所需的流速和壓力。流動相的粘度可通過改變?nèi)軇┏煞?、溫度或壓力來調(diào)節(jié)。

pH：流動相的 pH 值在高效液相色譜分離中非常重要，因為它會影響分析物和固定相的電離狀態(tài)。流動相的 pH 值應(yīng)根據(jù)被分離分析物和所用固定相的 pKa 值進(jìn)行調(diào)節(jié)。例如，堿性流動相適合分離酸性化合物，而酸性流動相則適合分離堿性化合物。

離子強度：流動相的離子強度是指溶液中離子的濃度，它通過改變分析物與固定相之間的靜電相互作用來影響分離效率。流動相的離子強度可通過改變?nèi)芤褐宣}或緩沖液的濃度來調(diào)節(jié)。

流動相的選擇標(biāo)準(zhǔn)：流動相的選擇在高效液相色譜分離中至關(guān)重要，取決于多個因素，包括分析物的化學(xué)性質(zhì)、固定相和分離目標(biāo)。

流動相的優(yōu)化：流動相的優(yōu)化在高效液相色譜分離中至關(guān)重要，因為它能顯著影響分離效率和選擇性。流動相的優(yōu)化包括調(diào)整流動相的特性，以達(dá)到理想的分離效果。流動相相當(dāng)于液相的血液，在使用過程中會有各種需要注意的事項。其中有些“坑"千萬要注意。

加入有機溶劑之后測量移動相酸堿度

如果你用有機添加劑測量pH值，得到的pH值會與添加有機溶劑之前的值不同。然而，最重要的一點是要保持一致。如果你總是在加入有機溶劑之后測量pH值，那么務(wù)必保證在使用的方法中陳述你的步驟，這樣的話其他人就會按照統(tǒng)一方式進(jìn)行。這種方式并不保證準(zhǔn)確，但是至少可以保持方法的前后統(tǒng)一。這也許會比得到精準(zhǔn)的pH值更加重要。

沒有使用緩沖液

緩沖劑的作用就是用來控制PH值并阻止其發(fā)生變化。很多其他方法會改變流動相的PH值，會引起停留時間、峰形以及峰值響應(yīng)的漂移。甲酸、TFA等不是緩沖劑

沒有在正常酸堿度范圍內(nèi)使用緩沖液

每個緩沖鹽有2個pH單位范圍寬度，在這個范圍內(nèi)可以提供穩(wěn)定性的pH值。窗口之外的緩沖鹽不具備有效的抗pH值變化能力。要么在正確的范圍內(nèi)使用緩沖劑，要么選擇一種緩沖劑可以涵蓋你所需要的pH值。

向有機溶液中加緩沖液

將緩沖溶液與有機相混合，會極有可能引起緩沖液沉淀。在很多情況下，即使沉淀現(xiàn)象已經(jīng)發(fā)生了，但仍很難被發(fā)現(xiàn)。記住，一定要將有機溶液加入到水相當(dāng)中，這可以很好的降低緩沖液沉淀的幾率。 

從0%用泵混合濃度梯度

現(xiàn)在使用的泵可以有效的混合流動相并實現(xiàn)在線脫氣，但并不是使用你的方法的任何人都會配有高質(zhì)量的泵。將A和B混合到一個單獨的溶液中，在99%線上運行。比如說通過用50ml水混合制備有機950ml起始混合物。這樣做的好處就是可以減少HPLC之間的可變性，減少系統(tǒng)中產(chǎn)生氣泡和沉淀的可能性。值得注意的是泵混合液的比例是95:5并不代表瓶體的預(yù)混合保留時間也為95:5。

不要使用正確的改性酸（堿）改變緩沖液只能使用形成你使用的緩沖鹽的酸或堿

比如磷酸鈉緩沖液應(yīng)僅用磷酸或*調(diào)節(jié)。

沒有在方法中闡述有關(guān)緩沖液的全部信息，比如說在1000ml的水中加入5g磷酸鈉。緩沖劑的類型決定了能夠緩沖的PH范圍。所需的濃度決定了緩沖強度。5克或無水磷酸鈉和5克一水合物磷酸一鈉具有不同的緩沖強度。

0還沒先檢查就開始溶劑

如果上一個方法中基線B中使用過的是緩沖液，而你的方法中，基線B使用的是有機溶液，好在你可以沉淀泵管和泵頭中的緩沖劑。

支起瓶體清空滴

很有可能你沒有足夠的流動相完成整個操作，最后樣品會冒煙的。除了可能存在燒干泵系統(tǒng)和柱子的可能性之外，流動相也會蒸發(fā)的一干二凈，瓶體頂部的流動相會發(fā)生變化。

利用超聲脫氣的流動相

最重要的一點就是確保所有的緩沖鹽已經(jīng)溶解，但是這是一種效果最差的脫氣方式，并且它會很快讓流動相升溫，從而引起有機成分蒸發(fā)掉。為了省去之后不必要的麻煩，請用五分鐘時間使用真空過濾你的流動相。

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