等度（流動(dòng)相組成不變）

等度優(yōu)化的一般方法是不斷改變流動(dòng)相強(qiáng)度（%B），直到獲得適當(dāng)?shù)谋Ａ舴秶?。這種方法有時(shí)也稱為“溶劑篩查"。對于簡單的分離，k 值應(yīng)在 1 到 10 之間。如果 k 值太低（比如，< 1），早洗脫的色譜峰可能不發(fā)生保留峰或融入基質(zhì)組分，因此對其進(jìn)行定量將非常困難而且不可重復(fù)。另外，低 k 值峰受柱外效應(yīng)影響很大，可能會(huì)使峰展寬。如果 k 值太大（比如，> 10），分析時(shí)間將變得過長，檢測限會(huì)因峰展寬而提高。

對于反相色譜中的等度方法開發(fā)是從流動(dòng)相有機(jī)改性劑比例開始，然后逐漸降低。在降低流動(dòng)相強(qiáng)度之前，先要確定所有組分都已從柱中洗出。如果組分保留在色譜柱中，以后可能在 B 相比例較低的流動(dòng)相中洗脫，成為無法解釋的“鬼峰"。通常，流動(dòng)相以 +/-10%（如，90% B、80% B、70% B 等）或 +/-20% 的幅度改變。利用一些現(xiàn)代軟件（如，ChromSword 的 ChromSword，ACD 的 AutoChrom），顯示保留變化曲線，系統(tǒng)進(jìn)行自動(dòng)調(diào)節(jié)，更快得到優(yōu)化條件。當(dāng)接近等度條件時(shí)，進(jìn)行手動(dòng)調(diào)節(jié)，幅度應(yīng)減為 5% 或 3%。

請注意，如果流動(dòng)相“A"中含高濃度緩沖液（比如，大于 25 mM），則不能使用 99% 的 B，因?yàn)楫?dāng)兩種溶劑系統(tǒng)開始混合，隨著 B 相百分比的減少，可能發(fā)生沉淀。一旦建立優(yōu)化條件，如果目標(biāo)還沒有得到分離，則需繼續(xù)提高選擇性 (α)。如需分離兩個(gè)相鄰的色譜峰會(huì)涉及到許多實(shí)驗(yàn)參數(shù)的調(diào)節(jié)。溫度可以作為一個(gè)變量。大多數(shù)現(xiàn)代儀器都具有某種類型的柱溫控制器，大部分反相柱可以承受高達(dá) 60 ℃ 的溫度，有些甚至更高。一般來說，升高溫度可以縮短所有峰的保留時(shí)間，但對有些峰的影響可能與對其它峰不同，從而導(dǎo)致選擇性發(fā)生變化。

其它用于改變選擇性的變量如下：

1. pH（對于可離子化的化合物）

2. 緩沖液（離子）強(qiáng)度

3. 緩沖液類型（比如，磷酸鹽、醋酸鹽或甲酸鹽，取決于需要的 pH 范圍）

4. 流動(dòng)相有機(jī)改性劑（比如，從乙腈變?yōu)榧状蓟騼烧叩幕旌弦?；可使用三元和四元流?dòng)相混合溶劑）

5. 流速（一般而言，由于提高了柱效，較低的流速可能對分離略有改善，但也有例外——見下面的提示）

6. 離子對試劑濃度（如果使用離子對 RPC）

如果調(diào)節(jié)這些參數(shù)還不能改善分離，那么解決辦法就是改變色譜柱或固定相。更長的色譜柱具有更多塔板數(shù)，因此有助于分離，但切記，分離度只能增加長度的平方根。柱長加倍使分析時(shí)間和溶劑消耗加倍，而靈敏度降低，但只能使分離度提高約 40%。改用較小粒度色譜柱也能增加塔板數(shù)，但柱壓上升 。使用新的固定相（如 C18 換成苯基柱）需要進(jìn)行一套新的溶劑篩選實(shí)驗(yàn)，耗費(fèi)更多時(shí)間，但可能得到的分離結(jié)果。但需要額外購買具有不同固定相的反相柱。

梯度（流動(dòng)相強(qiáng)度隨時(shí)間變化）

對于含各種組分的樣品混合物來說，選擇單動(dòng)相組分可能得不到滿意的解決方案（比如，一般洗脫問題）。例如，某些樣品組分，如強(qiáng)極性分析物，可能很快從反相柱上被洗脫下來，而疏水性組分可能在疏水性的 C8 或 C18 上吸附非常強(qiáng)，洗脫不下來。對這一問題的解決方案是隨時(shí)間改變流動(dòng)相組成（梯度洗脫）。在絕大多數(shù)例子中，初始流動(dòng)相非常弱（比如，含水量高），隨時(shí)間的推移，有機(jī)溶劑的百分比通常是以線性形式增加。

兩種情況下要使用梯度洗脫的方法開發(fā)過程。一種是用梯度預(yù)測反相分離的起始等度條件。大多數(shù)方法開發(fā)軟件（如，DryLab、ChromSword、AutoChrom）都具有這項(xiàng)功能，最少進(jìn)行兩次梯度分離，然后預(yù)測出等度條件。接下來就可以用這些條件進(jìn)一步進(jìn)行等度分離優(yōu)化了。

第二種情況是開發(fā)梯度方法，并使用了寬范圍的快速梯度（比如，10 分鐘內(nèi) B 由 5% 變到 95%），確定目標(biāo)化合物的梯度范圍。實(shí)際上，某些軟件系統(tǒng)可以通過色譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)/控制器之間的相互作用來設(shè)置梯度，對分離進(jìn)行優(yōu)化。但是，手動(dòng)操作也可以完成同樣的工作，找到目標(biāo)峰洗脫的流動(dòng)相比例，然后通過下一次梯度，調(diào)節(jié) k*（梯度等于 k）范圍，讓梯度分離在合理的時(shí)間內(nèi)完成。

然后，與等度優(yōu)化一樣，當(dāng)分離時(shí)間合理后進(jìn)行選擇性的確定。

HILIC色譜柱

親水相互作用液相色譜 (HILIC) – 有時(shí)也被稱為“水相正相"(ANP) – 是一項(xiàng)已發(fā)展了數(shù)十年的技術(shù)。由于這項(xiàng)技術(shù)能夠?qū)Ψ聪嘀喜槐Ａ艋虮Ａ糨^差的極性化合物進(jìn)行分析，近年來又重新受到了重視。而且，這項(xiàng)技術(shù)很容易與 MS 和 MS-MS 檢測技術(shù)兼容。當(dāng) HILIC 分離使用高有機(jī)相流動(dòng)相時(shí)，與水相緩沖系統(tǒng)相比由于具有較低的離子抑制，從而提高了 MS 靈敏度。

HILIC 使用極性固定相，如硅膠、氨基、混合模式、兩性離子等，以及水溶性的、非極性流動(dòng)相，由少量水（至少 2.5% 體積比）和高比例有機(jī)相組成。

在 HILIC 方法中，親水、極性和帶電荷化合物比疏水、中性化合物更容易保留。與反相液相色譜相反。

在流動(dòng)相中加水會(huì)降低保留。HILIC 與正相色譜相比，能得到強(qiáng)極性溶質(zhì)的良好峰形。是反相色譜的補(bǔ)充方法，由于保留了親水性化合物，因此常使洗脫順序倒置。

正相色譜

正相或吸附色譜的出現(xiàn)早于反相色譜?！罢?的叫法源自其原本概念，即，固定相為極性、流動(dòng)相為非極性、極性化合物保留更強(qiáng)。

在正相色譜中，使用硅膠或另一種極性固定相，如短鏈氨基或二醇。流動(dòng)相為非極性——通常為烴類、二氯甲烷、乙酸乙酯，或另一種水溶性的溶劑。在正相色譜中，極性組分保留更強(qiáng)。隨流動(dòng)相極性增大極性組分保留減弱。使用的流動(dòng)相極性越強(qiáng)，分析物的洗脫越快。在硅膠柱上進(jìn)行正相梯度分離時(shí)，可以從己烷等非極性溶劑開始，然后逐漸加入極性溶劑，如乙酸乙酯，比如，乙酸乙酯從 5% 到 95%。根據(jù)目標(biāo)物的洗脫位置，可以調(diào)節(jié)梯度以改善所有組分的分離。有時(shí)加入一定量的水或少量異丙醇，可以調(diào)節(jié)硅膠填料的表面活性。鍵合相色譜柱可能不需要水的存在，并常使用醇類作為改性劑。

我們使用正相色譜的原因之一是使更多的極性化合物得到保留。也可以用這種模式洗脫在反相色譜中高度保留的疏水化合物。

正相色譜有許多用途。適合分離幾何異構(gòu)體和位置異構(gòu)體?？傻玫奖确聪嗌V更高的分辨率。當(dāng)我們沒有水溶性的溶劑時(shí)，可以使用正相色譜。也可以用于制備分離，流動(dòng)相不含水，易于蒸發(fā)。

總結(jié)：正相

? 柱填料為極性：硅膠（）>氨基>二醇>氰基（最弱）

? 流動(dòng)相為非極性：己烷、異辛烷、二氯甲烷、乙酸乙酯等

? 極性化合物保留更強(qiáng)

? 隨流動(dòng)相極性增大保留減弱

選擇正相的目的：

? 分離高度保留的疏水樣品

? 分離異構(gòu)體

? 樣品進(jìn)樣溶劑為非極性和/或非水溶性的

? 使用非極性溶劑進(jìn)行回收

離子交換色譜

離子交換色譜可以分離離子型化合物和可離子化的化合物。在這種模式中，我們使用帶有離子型官能團(tuán)的填料，其所帶電荷與分析物相反。在強(qiáng)陽離子交換 (SCX) 色譜中，我們要分析帶正電荷的分子或陽離子，因此使用的是陰離子型或帶負(fù)電荷的固定相。如果我們要分析帶負(fù)電荷的分子或陰離子，應(yīng)使用陽離子型或帶正電荷的固定相。

在離子交換色譜中，流動(dòng)相通常含水量較高，并含有緩沖液或鹽。通過連續(xù)或階梯梯度增加離子強(qiáng)度（鹽濃度）進(jìn)行洗脫。常用于對生物大分子的分離，也用于小分子的分離，如氨基酸、無機(jī)陽離子和陰離子，以及氨類或羧酸等可離子化的化合物。

凝膠滲透色譜/體積排阻色譜

在 GPC/SEC 中，樣品分子與填料之間不存在相互作用，并通過擴(kuò)散進(jìn)入多孔聚合物基質(zhì)或硅膠基質(zhì)的孔隙中。根據(jù)分子的體積大小和相應(yīng)填料孔隙大小進(jìn)行分離。體積比填料孔隙大的分子不能擴(kuò)散進(jìn)入填料，而體積比填料孔隙小的分子則可以進(jìn)入填料，因此樣品得到分離。與反相色譜不同的是，大分子先洗脫出來，小分子后洗脫出來。

通常，較大分子被排阻在孔隙之外，從而快速從色譜柱中洗脫出來，為排阻體積。最小的分子可以滲透入色譜柱的所有孔隙，最后洗脫出來，為滲透體積。其它所有分子在這兩者之間按分子大小洗脫出來。如果要測定單個(gè)組分的分子量 (MW) 或整體分布，需要先用已知分子量的標(biāo)樣以洗脫體積對 log MW 建立校正曲線。然后，在與標(biāo)樣相同的條件下分析聚合物樣品，即可測定該聚合物的分子量和分子量分布。

主要選用流動(dòng)相溶解分析物。

GPC/SEC 小結(jié)：

? 兩種模式：非水相 GPC 和水相 SEC（也稱凝膠過濾色譜，或 GFC）

? 在體積排阻色譜中，樣品分子與填料之間無相互作用，并通過擴(kuò)散進(jìn)入多孔聚合物基質(zhì)的孔隙中。根據(jù)分子的體積大小和相應(yīng)填料孔隙大小進(jìn)行分離。在不同溶劑或流動(dòng)相中可能得到不同的流體動(dòng)力學(xué)半徑。

? 主要選用流動(dòng)相溶解分析物

? 主要用于聚合物表征、聚合物分子量測定和蛋白質(zhì)分離

本文為轉(zhuǎn)發(fā)內(nèi)容，文本源于網(wǎng)絡(luò)，其觀點(diǎn)不代表本平臺(tái)立場，內(nèi)容僅供參考！如有侵權(quán)，請聯(lián)系刪除。