原代細胞懸液標(biāo)本制備實驗步驟

(1)取材：原代細胞收集對數(shù)生長期細胞于離心管中，800～1000r／min離心10min，棄上清，彈指法混勻細胞。沿管壁加入2．0％～2．5％冷戊二醛，輕輕吹打，4℃固定30min。用小鋁片將細清。4℃PBS緩沖液沖洗1～2h或過夜，1000r／min離心5min，棄上清。

(2)制備預(yù)包埋塊：管內(nèi)加入2％～4％37℃瓊脂糖液0．1～0．5ml，兩手搓離心管，使細胞與瓊脂糖混勻，室溫冷卻，形成細胞瓊脂凝膠預(yù)包埋塊。離心管內(nèi)加適量PBs緩沖液或75％乙醇溶液，鋁片沿管輕輕地將細胞瓊脂糖凝膠塊松動，預(yù)包埋塊移入含75％乙醇溶液的青霉素瓶內(nèi)，24h后換固定液一次，4℃保存，1年內(nèi)使用。

(3)固定：預(yù)包埋塊切成1mm3大小，置1％鋨酸4℃固定1～2h。

(4)漂洗與脫水：PBS緩沖液反復(fù)漂洗30min或過夜。分別用50％、70％、90％、100％丙酮脫水各1次，每次10～15min；100％丙酮脫水3次，每次30min。

(5)浸透、包埋與聚合：浸入稀釋包埋劑(丙酮：包埋劑為1：1)中，室溫1h。再浸入純包埋劑(如環(huán)氧樹脂)中，37℃過夜。60℃固化48h。干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

(6)超薄切片：原代細胞首先將標(biāo)本包埋塊頂端修成近45。的四邊錐體，使標(biāo)本暴露出來，切面呈長寬約為0．4mm～0. 6mm的長方形或梯形。然后將其夾在標(biāo)本夾中，固定在切片機上。玻璃切片刀需用膠布圍成水槽，加入適量蒸餾水，使切下的薄片漂在水面，用覆有支持膜(透明塑膠膜)的載網(wǎng)(銅網(wǎng)或鎳網(wǎng))收集?？梢愿鶕?jù)薄片與水面反射光所產(chǎn)生的干涉色判斷切片的厚度：以銀白色(50～70nm)為；薄片大于l00nm(紫紅色)，電子束的穿透較差，微細結(jié)構(gòu)辨別不清；但小于40nm(暗灰色)圖像反差低，難以觀察。

(7)染色：在平皿中放一片蠟紙，并在其上滴1滴乙酸鈾染液，用彎頭小鑷子夾住載網(wǎng)邊緣，把貼有薄片的一面朝下，輕輕插入染液中，蓋上平皿蓋，室溫下染色10～20min，雙蒸水清洗2次；置人枸櫞酸鉛染液中染色15min，0. 1mol/L NaOH染液漂洗1～2s，雙蒸水清洗2次。

(8)觀察：原代細胞切片自然干燥后觀察。