（貨號：WLN5002）

原理概述：

本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴增技術：在常溫恒溫下，重組酶和引物形成蛋白/單鏈核苷酸的復合體Rec/ssDNA，在輔助蛋白和單鏈結合蛋白SSB的幫助下，侵入雙鏈DNA模板；在侵入位點形成D-loop區(qū)域，并開始對DNA雙鏈進行掃描；待找到與引物互補的目的區(qū)域后，復合體Rec/ssDNA解體的同時，聚合酶也結合到引物的3’末端，開始鏈的延伸。依賴nfo酶的作用，加入根據(jù)模板設計的特異的分子探針，使用膠體金技術（三明治夾心法）可以對最終結果進行檢測。

引物設計：

建議使用長度在 30-35 bp的引物，引物過短會影響擴增速度和檢測靈敏度；下游引物的5’端標記一個修飾基團（常用）。引物設計避免形成二級結構而影響擴增；擴增子長度建議在150-300 bp，通常不超過500 bp。

探針設計：

探針序列不與特異性引物識別位點重疊，長度為46-52 nt，序列避免回文序列、內部二級結構和連續(xù)的重復堿基。探針共有三個修飾位點：5’端修飾一個抗原標記（典型FAM）;在5’端和3’末端的中部位置標記一個dSpacer（*，THF），作為nfo的識別位點；3’末端標記一個修飾基團，例如胺基、磷酸基團或C3-Spacer等。

試劑盒組成：

100T/盒

試劑盒儲存：

運輸條件：低溫運輸；

儲存條件：儲存溫度 ≤ -20 oC，避光保存，避免重壓、反復凍融；

產品有效期：6個月

操作步驟：提前將試劑盒所需組分取出，冰上或低溫下融化（C buffer可室溫融化），震蕩混勻。

1) 向無菌0.2mL PCR管中加入20 μL C buffer、5 μL L buffer；

2) 加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探針，再加入1.5μL dNTPs(10 mM)；

3) 向反應管中加入12 μL P-core和0.6 μLN-core，（步驟1~3可以混合后再分裝至反應管中）；

4) 向反應管中加入3.8 μL核酸模板；

5) 最后向反應管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（請務必上下顛倒甩動反應管8-10次進行混勻；對于多個反應，建議提前將B buffer加至反應管的蓋子內側，蓋上蓋后上下顛倒后混勻）；混勻后，將反應液甩（或快速離心）至管子底部，然后立即將反應管放入恒溫設備中39 oC孵育8-12 min。

6) 反應結束后，取10 μL加入含有190 μL ddH2O的離心管中，混合均勻后，將膠體金試紙條的樣品端插入離心管中平衡，5 min內觀察質控線與檢測線判讀結果。

體系配制

注意事項：

• 為保證液體試劑組分活性，請保證儲存溫度 ≤ -20 oC；試劑使用時請保持低溫，避免高溫放置過長時間；

在進行反應時請注意避免微量核酸染，并設置空白對照實驗組。