（貨號(hào)：WLE5003）

原理概述：

本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)：在常溫恒溫下，重組酶和引物形成蛋白/單鏈核苷酸的復(fù)合體Rec/ssDNA，在輔助蛋白和單鏈結(jié)合蛋白SSB的幫助下，侵入雙鏈DNA模板；在侵入位點(diǎn)形成D-loop區(qū)域，并開始對(duì)DNA雙鏈進(jìn)行掃描；待找到與引物互補(bǔ)的目的區(qū)域后，復(fù)合體Rec/ssDNA解體的同時(shí)，聚合酶也結(jié)合到引物的3’末端，開始鏈的延伸。本試劑盒在39 oC下，依賴核酸外切酶的作用，加入根據(jù)模版設(shè)計(jì)的特異的分子探針，使用熒光監(jiān)測(cè)設(shè)備能實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)片段擴(kuò)增過程的實(shí)時(shí)監(jiān)控。

引物設(shè)計(jì)：

建議使用長度在30-35 bp的引物，引物過短會(huì)影響擴(kuò)增速度和檢測(cè)靈敏度；引物設(shè)計(jì)避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)而影響擴(kuò)增；擴(kuò)增子長度建議在150-300 bp，通常不超過500 bp。

熒光探針設(shè)計(jì)：

探針序列不與特異性引物識(shí)別位點(diǎn)重疊，長度為46-52 nt，序列避免回文序列、內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)和連續(xù)的重復(fù)堿基。探針共有四個(gè)修飾位點(diǎn)：距離5’端的≥35 nt的中部位置標(biāo)記一個(gè)dSpacer（*，THF），作為核酸外切酶的識(shí)別位點(diǎn)；THF位點(diǎn)的上游標(biāo)記一個(gè)熒光基團(tuán)，下游標(biāo)記一個(gè)粹滅基團(tuán)，兩個(gè)基團(tuán)的間距為2-4 nt；THF距離3’末端≥15 nt，并且3’末端標(biāo)記一個(gè)修飾基團(tuán)，例如胺基、磷酸基團(tuán)或C3-Spacer。

試劑盒組成：

100T/盒

試劑盒儲(chǔ)存：

運(yùn)輸條件：低溫運(yùn)輸；

儲(chǔ)存條件：儲(chǔ)存溫度 ≤ -20 oC，避光保存，避免重壓、反復(fù)凍融；

操作步驟：提前將試劑盒所需組分取出，冰上或低溫下融化（C buffer可室溫融化），震蕩混勻。

1) 向無菌0.2mL PCR管中加入20 μL C buffer、5 μL L buffer；

2) 加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探針，再加入1.5μL dNTPs(10 mM)；

3) 向反應(yīng)管中加入12 μL P-core和0.6 μL E-core，（步驟1~3可以混合后再分裝至反應(yīng)管中）；

4) 向反應(yīng)管中加入3.8 μL核酸模板；

5) 最后向反應(yīng)管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（加入B buffer反應(yīng)立即被啟動(dòng)）；混勻后，將反應(yīng)液甩（或快速離心）至管子底部，然后立即將反應(yīng)管放入熒光檢測(cè)設(shè)備中。熒光檢測(cè)程序設(shè)置為：恒溫39 oC；每30 s采集一次熒光信號(hào)；反應(yīng)時(shí)間20 mins。

注：如使用ABI系列PCR儀，請(qǐng)務(wù)必于passive reference和quencher處均選擇“none”。

體系配制

注意事項(xiàng)：

• 為保證液體試劑組分活性，請(qǐng)保證儲(chǔ)存溫度 ≤ -20 oC；試劑使用時(shí)請(qǐng)保持低溫，避免高溫放置過長時(shí)間；
• 在進(jìn)行反應(yīng)時(shí)請(qǐng)注意避免微量核酸染，并設(shè)置空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)組。