【儀表網(wǎng) 研發(fā)快訊】 冷凍電鏡(cryo-EM)已從結(jié)構(gòu)生物學(xué)拓展至藥物發(fā)現(xiàn)、電池設(shè)計(jì)、材料創(chuàng)新和半導(dǎo)體制造等多個(gè)跨學(xué)科應(yīng)用領(lǐng)域。在冷凍電鏡成像中，樣品需包埋于玻璃態(tài)冰層中，而冰層厚度直接影響成像背景噪聲、樣品分布和最終分辨率。因此，獲得厚度合適且均勻的冰層是成功解析結(jié)構(gòu)的前提。然而，近半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，冷凍電鏡中的冰厚控制始終是關(guān)鍵難題：現(xiàn)有制樣技術(shù)重復(fù)性差，所得冰層厚度不均，且厚度控制主要依賴經(jīng)驗(yàn)試錯(cuò)。針對(duì)這一難題，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院彭海琳教授團(tuán)隊(duì)、清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王宏偉教授團(tuán)隊(duì)、香港大學(xué)生物科學(xué)學(xué)院劉楠教授團(tuán)隊(duì)合作，在《自然-方法》(Nature Methods)在線發(fā)表題為“Control of ice thickness in cryo-EM via confinement”的研究論文。該工作以國(guó)產(chǎn)深紫外光刻膠(彤程新材)構(gòu)筑圓孔陣列，并利用石墨烯下垂形成“石墨烯儲(chǔ)液池”，將“石墨烯儲(chǔ)液池”用于冷凍電鏡樣品制備，可精確控制樣品的冰層厚度，所得冰層厚度均勻、重復(fù)性高，為高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析提供了一種新的制樣策略。
 

　　研究團(tuán)隊(duì)指出，精確控制冰層厚度的瓶頸在于：亞100納米液膜本身就不穩(wěn)定，液體會(huì)自發(fā)地從較薄區(qū)域向較厚區(qū)域遷移，導(dǎo)致液膜破裂甚至形成液滴，從而使冰層厚度難以控制，且重復(fù)性差。為此，研究團(tuán)隊(duì)從限域效應(yīng)入手，采用工業(yè)兼容的深紫外光刻技術(shù)制備出孔邊緣光滑的均勻孔陣列，并將石墨烯轉(zhuǎn)移至多孔支撐膜上。在范德華力的作用下，石墨烯會(huì)自發(fā)貼附于孔壁并向下凹陷，形成“石墨烯儲(chǔ)液池”。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)調(diào)節(jié)孔直徑、孔邊緣曲率和石墨烯層數(shù)等參數(shù)，可精確調(diào)控石墨烯儲(chǔ)液池的深度：當(dāng)孔直徑為600—2000納米時(shí)，石墨烯儲(chǔ)液池深度可在10—40納米之間調(diào)節(jié)。該工藝還可擴(kuò)展至4英寸規(guī)模，單批次即可制備超過(guò)500個(gè)自制載網(wǎng)，具備批量制備能力。
 

　　得益于上述限域結(jié)構(gòu)，在薄液膜條件下，液體能夠自發(fā)地從較薄的外圍區(qū)域向較厚的石墨烯儲(chǔ)液池遷移，使體系表現(xiàn)出優(yōu)異的儲(chǔ)液能力。在實(shí)踐中，即便使用濾紙夾吸載網(wǎng)的時(shí)間延長(zhǎng)至10秒甚至20秒，液膜仍能保持穩(wěn)定，最終形成的冰層厚度穩(wěn)定在約30納米。該厚度適合高分辨率冷凍電鏡成像：既能有效封裝生物大分子，同時(shí)也不會(huì)引入額外的背景噪音。更重要的是，冰層厚度與儲(chǔ)液池深度高度匹配：通過(guò)調(diào)節(jié)儲(chǔ)液池深度，可實(shí)現(xiàn)15納米、20納米、30納米和40納米的冰層厚度可控制備，并在整個(gè)載網(wǎng)區(qū)域表現(xiàn)出良好的大面積均勻性。這表明，該限域策略不僅能有效抑制薄液膜失穩(wěn)，也為冰層厚度的精確調(diào)控提供了可靠途徑。
 

　　研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步將該策略拓展至更具挑戰(zhàn)性的石墨烯三明治體系。傳統(tǒng)石墨烯三明治雖在材料科學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)等領(lǐng)域備受關(guān)注，但其廣泛應(yīng)用長(zhǎng)期受限于厚度難以控制的問題。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，基于石墨烯儲(chǔ)液池的三明治結(jié)構(gòu)可形成厚度約30納米的均勻限域冰，所得冰層厚度分布較窄，并與儲(chǔ)液池的下垂深度高度匹配；并且，該結(jié)構(gòu)的封裝成功率超過(guò)90%，顯著高于傳統(tǒng)石墨烯三明治(約67%)。相比之下，傳統(tǒng)石墨烯三明治的冰厚約為52±18納米，且不同區(qū)域差異較大。與此同時(shí)，在石墨烯儲(chǔ)液池所制備的三明治結(jié)構(gòu)中，電子束輻照下樣品位移明顯降低且差異較小，圖像質(zhì)量也隨之提升。此外，當(dāng)石墨烯層數(shù)從單層增至3層時(shí)，其二維楊氏模量提高，儲(chǔ)液池深度減小，限域冰厚度因此可從約30納米進(jìn)一步調(diào)節(jié)至約19納米，這一結(jié)果與理論模型預(yù)測(cè)相符。上述結(jié)果表明，該策略不僅在傳統(tǒng)多孔載網(wǎng)上有效，在石墨烯三明治制樣構(gòu)型中同樣具有良好的適用性、穩(wěn)定性和可調(diào)控性。
 

　　在冷凍電鏡成像中，厚度可控且均勻的冰層為生物大分子提供了良好的襯度和信噪比，使該策略成功應(yīng)用于多種生物大分子的高分辨率三維重建。其中，LL.LtrB group II intron RNA、SARS-CoV-2 spike蛋白和52 kDa小蛋白streptavidin的三維重建分辨率分別達(dá)到2.7Å、2.9Å和2.5Å。這些生物大分子顆粒主要吸附在石墨烯-水界面，遠(yuǎn)離氣液界面，從而緩解了顆粒變性、聚集和優(yōu)勢(shì)取向等問題。此外，該方法還可用于噴霧制樣技術(shù)(spray methods)，有效促進(jìn)微量液滴在載網(wǎng)上自發(fā)鋪展，為時(shí)間分辨冷凍電鏡和原位液體電鏡等新興技術(shù)提供了新思路。
 

　　該研究聚焦冷凍電鏡樣品制備過(guò)程中薄液膜不穩(wěn)定的熱力學(xué)限制，將長(zhǎng)期依賴經(jīng)驗(yàn)的冰層厚度控制轉(zhuǎn)變?yōu)榭稍O(shè)計(jì)、可制造的限域結(jié)構(gòu)工程。這一策略不僅解決了冷凍電鏡制樣中的關(guān)鍵瓶頸問題，也為研究限域液體中的物理、化學(xué)和生物過(guò)程提供了有力工具。此外，該研究還揭示了納米圖案表面的流體行為，對(duì)光刻、刻蝕、清洗等半導(dǎo)體工藝具有重要的指導(dǎo)意義。
 

　　北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院鄭黎明博士、趙效樂博士，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院宋佶嶺博士為論文共同第一作者。該工作得到國(guó)家自然科學(xué)基金、國(guó)家重大科學(xué)研究計(jì)劃、北京分子科學(xué)國(guó)家研究中心、北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、騰訊新基石科學(xué)基金會(huì)等資助，并得到了光刻膠龍頭企業(yè)彤程新材的支持和幫助。
 

　　引用：化學(xué)與分子工程學(xué)院彭海琳?qǐng)F(tuán)隊(duì)及合作者基于光刻技術(shù)構(gòu)筑限域結(jié)構(gòu)，解決冷凍電鏡冰層控制難題-北京大學(xué)【引用時(shí)間：2026年10月3日】