上海欣軟避暗實(shí)驗(yàn)與曠場實(shí)驗(yàn)對老齡小鼠記憶行為的影響

摘　要: 用開場行為模型和一次性被動(dòng)回避反應(yīng)模型分別對經(jīng)高壓氧處理的老齡小鼠進(jìn)行自發(fā)活動(dòng)和記憶保持力檢測, 并用熒光分光光度計(jì)測定腦內(nèi)脂褐素含量, 探討了高壓氧（HBO）對衰老性學(xué)習(xí)記憶障礙的作用及其與腦內(nèi)脂褐素含量的關(guān)系. 結(jié)果表明: （1）高壓氧可明顯增強(qiáng)老齡小鼠在新異環(huán)境中的自發(fā)活動(dòng), 顯著提高其記憶保持力; （2）高壓氧使老齡小鼠腦內(nèi)脂褐素含量明顯下降. 提示高壓氧可改善衰老性記憶障礙, 其機(jī)制可能與其降低腦內(nèi)脂褐素含量有關(guān).

關(guān)鍵詞: 高壓氧; 開場行為; 一次性被動(dòng)回避反應(yīng); 脂褐素

　高壓氧（hyp e rba r ico xygen, HBO） 作為治療腦部疾病的一種非創(chuàng)傷性方法, 已廣泛應(yīng)用于腦缺血、顱腦損傷、持續(xù)性植物狀態(tài)、老年癡呆和血管性癡呆等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療, 對腦功能的恢復(fù)有良好的療效. 然而, 有關(guān)高壓氧對正常生理性衰老的作用鮮見報(bào)道. 筆者以往的實(shí)驗(yàn)表明, 高壓氧可改善衰老性記憶障礙, 并能降低與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的主要腦區(qū)（大腦皮層、海馬、小腦、間腦）突觸體內(nèi)鈣離子水平. 考慮到腦老化的動(dòng)因較多, 其中腦內(nèi)脂褐素積累是導(dǎo)致腦細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損、功能衰退的原因之一, 因此, 筆者觀察了高壓氧對衰老性記憶障礙和腦內(nèi)脂褐素含量的影響, 探討了高壓氧對衰老性學(xué)習(xí)記憶行為的作用機(jī)制.

1　材料與方法

1. 1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選 用昆明品系老齡（18月齡） 小鼠, 體重（35±3） g, 雌雄兼用, 由南京中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供.

1. 2　高壓氧處理

小鼠隨機(jī)分為常壓氧組（0. 10M P a）、高壓氧組（0. 25M P a）和對照組. 試驗(yàn)組動(dòng)物進(jìn)入自制動(dòng)

物加壓氧艙內(nèi), 先用醫(yī)用純氧充分洗艙10m in, 高壓氧組逐漸加壓至0. 25 M P a, 高壓下停留60m in, 之后以20m in勻速減至常壓; 常壓氧組則在常壓（0. 10M P a）下吸純氧60m in. 每天處理1h,共2周. 對照組小鼠常規(guī)飼養(yǎng).

1. 3　行為測試

（1）開場實(shí)驗(yàn)，曠場實(shí)驗(yàn)

觀察　zui后一次高壓氧處理后的第2天進(jìn)行. 開場環(huán)境底面劃分為許多格, 記錄小鼠3m in內(nèi)由底面中心開始跑動(dòng)所穿越的格數(shù)（同時(shí)記錄第1m in內(nèi)的跑動(dòng)格數(shù)）、后腿站立（包括扶壁站立和自由站立）次數(shù)、理毛次數(shù)和糞便粒數(shù). 比較高壓氧試驗(yàn)組與對照組小鼠在新異環(huán)境中自發(fā)行為表現(xiàn)的差異.

（2）一次性被動(dòng)回避反應(yīng)，避暗實(shí)驗(yàn)

　此模型用以測試小鼠的記憶保持力. 根據(jù)小鼠趨暗習(xí)性, 記錄其進(jìn)入暗箱前在通道上停留的時(shí)間, 即步入潛伏期（step2th ro ugh la tency, STL）; 動(dòng)物進(jìn)入暗箱受到電擊（0. 3mA, 50 H z, 5 s）后24h再測STL. STL越長, 表明小鼠對電擊的記憶保持越好. 檢測時(shí)間以300s為限.

1. 4　腦組織脂褐素含量測定

行為檢測后將小鼠斷頭取全腦, 加去離子水,用T ef lo n玻璃勻漿器進(jìn)行勻漿, 加入氯仿2甲醇（2∶1）溶液充分振蕩, 1 500 röm in離心10m in,取下層有機(jī)相, 用R F2540型熒光光度計(jì)測其熒光強(qiáng)度（發(fā)射波長435nm, 激發(fā)波長365nm）, 以1m göL硫酸奎寧為標(biāo)準(zhǔn)物, 計(jì)算每克鮮腦組織的脂褐素含量.

1. 5　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

開場行為和脂褐素含量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,用組間t 檢驗(yàn); 一次性被動(dòng)回避反應(yīng)采用M ann2

W h itney非參數(shù)檢驗(yàn).

2　結(jié)　果

2. 1　高壓氧對小鼠開場行為的影響

結(jié)果如表1. 與對照組相比, 高壓氧使老齡小鼠在開場環(huán)境中的跑動(dòng)格數(shù)增多, 特別是在第1m in的跑動(dòng)格數(shù)明顯多于對照組（P< 0. 01）, 后腿站立次數(shù)顯著增加（P< 0. 001）. 說明高壓氧可提高老齡小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性, 使其在新異環(huán)境中的自發(fā)活動(dòng)和探究行為明顯增多.

2. 2　高壓氧對小鼠一次性被動(dòng)回避反應(yīng)行為的影響

表2數(shù)據(jù)表明, 高壓氧對老齡小鼠電擊前的步入潛伏期（STL）沒有顯著影響, 但卻使電擊后24h的STL 明顯延長, 與對照組相比, 差異顯著（分別為P< 0. 05和P< 0. 01）. 說明高壓氧能明顯改善老齡小鼠的記憶保持能力.

3　討　論

在動(dòng)物的衰老過程中, 神經(jīng)系統(tǒng)特別是大腦的結(jié)構(gòu), 隨年齡的增長發(fā)生衰老性變化, 腦內(nèi)脂褐素積累即是其重要的形態(tài)學(xué)指標(biāo)之一. 脂褐素主要積累在大腦皮層和海馬部位. 以往的研究表明,老齡小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的減退與腦內(nèi)脂褐素含量的升高有關(guān). 脂褐素積累過多, 可破壞磷脂膜結(jié)構(gòu), 導(dǎo)致線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少以及空泡形成等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化, 并使神經(jīng)元數(shù)目減少, 從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能的減退.高壓氧可大幅度提高血中物理溶解氧量和血

氧張力, 提高腦細(xì)胞供氧量, 使有氧代謝旺盛, 改善腦細(xì)胞代謝及營養(yǎng), 促進(jìn)腦細(xì)胞分裂增生, 有利于腦損傷的修復(fù); 同時(shí), 高壓氧使顱內(nèi)動(dòng)脈收縮,血管阻力增加, 血流量減少, 顱內(nèi)壓下降. 因此,*已作為腦復(fù)蘇的重要急救手段之一,治療的加壓范圍多在0. 15M P a～0. 25M P a. 

本實(shí)驗(yàn)對老齡小鼠進(jìn)行高壓氧處理后, 發(fā)現(xiàn)經(jīng)0. 10M P a和0. 25M P a處理的老齡小鼠在新異環(huán)境中的自發(fā)活動(dòng)明顯增多, 記憶保持力均顯著提高. 與此相對應(yīng), 高壓氧處理后的老齡小鼠腦內(nèi)脂褐素含量明顯下降, 提示高壓氧改善衰老性記憶障礙的機(jī)制可能與其降低腦內(nèi)脂褐素含量有關(guān).有研究表明, 動(dòng)物在衰老過程中腦內(nèi)脂褐素積累與體內(nèi)自由基代謝發(fā)生混亂有關(guān). 衰老過程中產(chǎn)生的大量自由基超過機(jī)體的清除能力, 引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用的鏈?zhǔn)椒磻?yīng), 導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷,同時(shí), 過氧化脂質(zhì)（L PO）的分解終產(chǎn)物（如M DA）可與DN A、RN A、蛋白質(zhì)和磷脂等有關(guān)物質(zhì)結(jié)合使膜成分改變, 功能障礙, 促進(jìn)機(jī)體衰老過程. 脂質(zhì)過氧化的代謝終產(chǎn)物還可引起精神行為改變,并通過交聯(lián)、結(jié)合形成脂褐素, 引起神經(jīng)系統(tǒng)的功能障礙. 而高壓氧能增加體內(nèi)自由基清除劑——超氧化物歧化酶（SOD）的活性, 抑制脂質(zhì)過氧化過程, 阻斷自由基連鎖反應(yīng). 因此, 推測高壓氧改善老齡動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能的機(jī)制可能與此有關(guān), 并由此抑制腦內(nèi)脂褐素的積累, 使腦組織的損傷終止并逐漸修復(fù), 從而改善腦的記憶功能.