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實時熒光定量PCR定量PCR方法簡述2023/12/18

實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標準曲線獲得定量結果。因此，實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的：1、Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的Ct值是恒定的。2、Ct值與起始模板的線性關系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關

胎牛血清的質量從外觀辨別指引2023/12/11

如何從三方面外觀辨別胎牛血清的質量。1、顏色根據(jù)血紅蛋白含量的不同，胎牛血清可表現(xiàn)出黃色或紅色，我國的細胞培養(yǎng)用血清標準是不高于20mg/dl，實際上，血紅蛋白含量的高低對血清并無直接影響，這個指標的意義在于能體現(xiàn)出采血過程的嚴謹規(guī)范程度，良好的操作能降低血清的溶血。國產(chǎn)血清的采血點很分散，大多是由屠戶采血后馬上離心收集，所以很少會有溶血，表現(xiàn)出明亮的蠟黃色，當然，國產(chǎn)血清也很少有標準意義上的胎牛血清。進口胎牛血清或多或少總有點溶血，因為真正的胎牛血清凝血功能差，紅細胞容易破裂?？偟膩碚f，國產(chǎn)的

水稻內源基因PCR檢測試劑盒設計引物原則2023/12/04

水稻內源基因PCR檢測試劑盒設計引物原則：①引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。②引物擴增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物內部出現(xiàn)二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3’端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。⑤引物3’端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應嚴格要求配對

免疫共沉淀(Co-IP)優(yōu)缺點小結2023/11/28

以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經(jīng)典方法，是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。其原理是：當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內存在的許多蛋白質－蛋白質間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內結合的蛋白質Y也能沉淀下來。目前多用精制的proreinA預先結合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應后，beads上的proreinA就能吸附抗原達到精制的目的。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質是

顆粒培養(yǎng)基使用方法與注意事項2023/11/20

使用方法：1、取瓶內弧菌顯色培養(yǎng)基干粉71.3克，用1000ml蒸餾水或純水溶解，可按比例擴增或縮小。攪拌加熱煮沸至*溶解，不需高壓滅菌，冷至約50℃，傾注滅菌平皿。2、以無菌操作取檢樣25g(mL)，加入3%氯化鈉堿性蛋白胨水225mL，用旋轉刀片式均質器以8000r/min均質1min，或拍擊式均質器拍擊2min，或用Pulsifier脈沖式樣品處理器均質30秒，制備成1:10的均勻稀釋液。如無均質器，則將樣品放入無菌乳缽中磨碎，然后放在500mL的滅菌容器內，加225mL3%氯化鈉堿性蛋白

培養(yǎng)微生物6大營養(yǎng)來源解讀2023/11/13

微生物不是專用于生物分類學的名詞，而是指一般需借助顯微鏡才能看清的所有微小生物的統(tǒng)稱，數(shù)量龐大且多樣。微生物中的“微”便是它的特點之一，是人眼不能直接看到的，有些微生物只有粉塵那么大，而有些微生物更小，只有在放大幾千倍以上的情況下才能被看見。微生物也是生物，和人一樣，它的存活也需要汲取營養(yǎng)。營養(yǎng)是指生物體從外界環(huán)境中獲取生命活動所必須的能量和物質，來滿足正常生長和繁殖的需要，它是生物的一種最基本的生理功能，為一切生命活動提供所必需的物質基礎。而微生物對營養(yǎng)的需求和動植物很接近，其營養(yǎng)來源主要為碳

人彈性蛋白（ELN）檢測試劑盒應用注意事項2023/11/06

人彈性蛋白（ELN）檢測試劑盒應用注意事項：1．ELISA試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。2．濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。3．各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。4．請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大于標準品孔孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n

科研抗體的制備過程2023/10/30

抗體的制備過程：1.免疫原：普通的大分子蛋白，通過分子克隆構建載體并在大腸桿菌中進行誘導表達獲得重組蛋白，純化鑒定后可直接作為免疫原；小分子蛋白或化合物等分子量小，需要偶聯(lián)載體對該分子進行改造才能使其成為具有免疫原性的抗原，常見偶聯(lián)載體如BSA、OVA、HAS等。2.免疫動物：常用于制備抗血清的動物有豚鼠、家兔、雞、大小鼠等，大量生產(chǎn)時需要用到狗、綿羊、山羊等。3.免疫血清的收集：一般家兔、綿羊、山羊可采用靜動脈采血，家兔、豚鼠、大鼠、雞可采用心臟采血，家兔、山羊、綿羊可采用靜脈采血。4.免疫血

小鼠骨髓多能干細胞培養(yǎng)操作2023/10/23

小鼠骨髓多能干細胞培養(yǎng)操作：培養(yǎng)操作：一、復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。二、細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。2.加1ml消化液（0.25%Trypsi

多胺氧化酶(PAO)測試盒比色法活性計算2023/10/17

測定原理：PAO催化多胺氧化產(chǎn)生*，在過氧化物酶存在的條件下與底物顯色，在550nm下有特征吸收峰，通過測定吸光值增加速率來反映PAO活性。PAO活性計算：1、按樣本蛋白濃度計算：單位定義：每mg組織蛋白在每mL反應體系中每分鐘A550變化0.001為一個酶活力單位。PAO（U/mgprot）＝ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.001÷T=333.33×ΔA÷Cpr2、按樣本鮮重計算：單位定義：每g組織在每mL反應體系中每分鐘A550變化0.001為一個酶活力單位。PAO（U/g鮮重）＝ΔA×

培養(yǎng)基?間歇滅菌與連續(xù)滅菌比較2023/10/08

培養(yǎng)基間歇滅菌與連續(xù)滅菌比較:1、歇滅菌的優(yōu)點和缺點優(yōu)點是設備要求低，不需另外設置加熱、冷卻裝置；操作要求低，適于手動操作，適合于小批量生產(chǎn)規(guī)模；適合于含有大量固體物質的培養(yǎng)基的滅菌。缺點是培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質損失較多，滅菌后培養(yǎng)基的質量下降；需進行反復的加熱和冷卻，能耗較高；不適合于大規(guī)模生產(chǎn)過程的滅菌；發(fā)酵罐的利用率較低。2、連續(xù)滅菌的優(yōu)點和缺點優(yōu)點是滅菌溫度高，可減少培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質的損失；操作條件恒定，滅菌質量穩(wěn)定；易于實現(xiàn)管道化和自控操作；避免了復的加熱和冷卻，提高了熱的利用率；發(fā)酵設備利

原代細胞與傳代細胞培養(yǎng)不同點分析2023/10/05

區(qū)別一：定義不同原代細胞培養(yǎng)：原代培養(yǎng)是指由體內取出組織或細胞進行的首培養(yǎng)，也叫初代培養(yǎng)。傳代細胞培養(yǎng)：傳代培養(yǎng)是指需要將培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿（瓶）內，再進行培養(yǎng)的過程。對單層培養(yǎng)而言，80%匯合或剛匯合的細胞是較理想的傳代階段。區(qū)別二：特點不同原代細胞培養(yǎng)：與體內原組織在形態(tài)結構和功能活動上相似性大。由于培養(yǎng)的細胞剛剛從活體組織分離出來，故更接近于生物體內的生活狀態(tài)。這一方法可為研究生物體細胞的生長、代謝、繁殖提供有力的手段。同時也為以后傳代培養(yǎng)創(chuàng)造條件。傳代細胞培養(yǎng)

擴增曲線的四個時期解釋2023/09/25

擴增曲線是描述PCR動態(tài)進程的曲線，以循環(huán)數(shù)為橫坐標，以反應過程中實時熒光信號強度為縱坐標。理論上PCR過程中反應產(chǎn)物是以指數(shù)增長的，但隨著PCR循環(huán)數(shù)的增加，DNA聚合酶失活、dNTP和引物枯竭、反應副產(chǎn)物阻礙反應等原因，致使PCR的擴增效率降低，產(chǎn)物生成的速度逐漸減緩，因此擴增曲線是一條“S形”曲線。擴增曲線可以分成四個時期：基線期，指數(shù)期，線性期，平臺期?；€期：擴增曲線的水平部分，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物生成量的變化。指數(shù)期：PCR指數(shù)擴增期，擴增曲線起峰，每個循

PCR反應結果無擴增條帶分析2023/09/18

PCR反應結果無擴增條帶分析:1、酶失活或在反應體系中未加入酶。TaqDNA聚合酶因保存或運輸不當而失活，往往通過更換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結果。2、模板含有雜質。特別是對甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸，造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結果。3、變性溫度是否準確：PCR儀指示溫度與實際溫度是否相符，過高酶在前幾個循環(huán)就迅速失活；過低則模板變性不徹di。4、反應系統(tǒng)中污染了蛋白酶及核酸酶，應在未加Taq酶以前，將反應體系95℃加熱5-10分鐘。5、引物變質失效。人工合成的引物是否正確。是

細胞凍存及復蘇操作步驟2023/09/11

細胞凍存及復蘇操作步驟：一、凍存1、消化細胞，將細胞懸液收集至離心管中。2、1000rpm離心10分鐘，棄上清液。3、沉淀加含保護液的培養(yǎng)，計數(shù)，調整至5×106/ml左右。4、將懸液分至凍存管中，每管1ml。5、將凍存管口封嚴。如用安瓿瓶則火焰封口，封口要嚴，否則復蘇時易出現(xiàn)爆裂。6、貼上標簽，寫明細胞種類，凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細繩。7、按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘）→冰箱冷凍室（30分鐘）→低溫冰箱（－30℃1小時）→氣態(tài)氮（30分鐘）→液氮。注意：操作時應小心，以免液

PCR反應循環(huán)參數(shù)注釋2023/09/08

循環(huán)參數(shù):1.預變性模板DNAwan全變性與PCR酶的wan全激活對PCR能否成功至關重要，建議加熱時間參考試劑說明書，一般未修飾的Taq酶激活時間為兩分鐘。2.變性步驟循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列wan全變性，可能的情況下可縮短該步驟時間。變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹di，易造成擴增失敗。3.引物退火退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴增的長度適當下調作為退火溫度。然后在此次實驗基礎上做出預估。退火溫度對PCR的特異性有較大影響。4.引

單克隆抗體的性質鑒定方法2023/08/28

當獲得多個雜交瘤細胞株時，要了解哪一株是zui適用的，則一定要通過各種鑒定。分析常見的方法有：（一）Ig類型測定通常以免抗小鼠Ig類及亞類抗體與培養(yǎng)液中單克隆抗體按雙向瓊脂擴散法進行測定，確定其Ig類型或Ig亞類型別。（二）特異性測定把與相應抗原有關的物質同McAb進行多種免疫學檢測，鑒定McAb的特異性。這直接關系到McAb應用的可靠性。（三）抗體效價測定效價以腹腔積液或培養(yǎng)液的稀釋度表示，稀釋度越高，則抗體效價也越高。在凝集反應中，腹腔積液效價可達5萬以上；在ELISA中，腹腔積液效價可達1

胎牛血清質控外觀判定要素2023/08/21

拿到血清，zui先接觸的是血清外觀，對于缺少細胞培養(yǎng)經(jīng)驗的人來說，外觀的判斷尤為重要。1、顏色根據(jù)血紅蛋白含量的不同，胎牛血清可表現(xiàn)出黃色或紅色，我國的細胞培養(yǎng)用血清標準是不高于20mg/dl，實際上，血紅蛋白含量的高低對血清并無直接影響，這個指標的意義在于能體現(xiàn)出采血過程的嚴謹規(guī)范程度，良好的操作能降低血清的溶血。國產(chǎn)血清的采血點很分散，大多是由屠戶采血后馬上離心收集，所以很少會有溶血，表現(xiàn)出明亮的蠟黃色，當然，國產(chǎn)血清也很少有標準意義上的胎牛血清。進口胎牛血清或多或少總有點溶血，因為真正的胎

大鼠子宮內膜基質細胞操作要點2023/08/17

大鼠子宮內膜基質細胞操作要點：1、將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預熱；準備一個15mL無菌的離心管，加入8mL預熱培養(yǎng)基。2、將凍存細胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復溫（可準備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細胞凍存管取出后迅速放入燒杯內，再逐步轉移到水浴鍋中）。輕輕晃動凍存管，使細胞能在1~2min內*解凍，使細胞能盡快通過最易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，BRL(大鼠肝細胞)避免引起污染。3、用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺內，將管內細胞轉移至準備好的離心管內，

熒光定量PCR擴增曲線四個時期2023/08/07

擴增曲線是描述PCR動態(tài)進程的曲線，以循環(huán)數(shù)為橫坐標，以反應過程中實時熒光信號強度為縱坐標。理論上PCR過程中反應產(chǎn)物是以指數(shù)增長的，但隨著PCR循環(huán)數(shù)的增加，DNA聚合酶失活、dNTP和引物枯竭、反應副產(chǎn)物阻礙反應等原因，致使PCR的擴增效率降低，產(chǎn)物生成的速度逐漸減緩，因此擴增曲線是一條“S形”曲線。擴增曲線可以分成四個時期：基線期，指數(shù)期，線性期，平臺期?；€期：擴增曲線的水平部分，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物生成量的變化。指數(shù)期：PCR指數(shù)擴增期，擴增曲線起峰，每個循